Denne orthotopisk model af human prostatacancer giver mulighed for kvantificering af tumorstørrelse cirkulerende tumorceller, og dannelse af særskilte metastase til lungen. Som celler skal undslippe det primære organ, ind i blodet, og implantatet i et sekundært site, denne model reelt rekapitulerer scenariet i mennesker.
Vores laboratorium har udviklet en ny ortotopisk implantation model af human prostatacancer (PSA). Da PCa døden ikke på grund af den primære tumor, men dannelsen af særskilte metastase, evnen til effektivt at modellere denne progression præ-klinisk er af stor værdi. I denne model celler implanteres direkte ind i den ventrale Lap af prostata i Balb / c athymiske mus og tillades at udvikle sig i 4-6 uger. Ved forsøg afslutning kan måles flere særskilte endpoints såsom størrelse og molekylær karakterisering af den primære tumor, tilstedeværelse og kvantificering af cirkulerende tumorceller i blod og knoglemarv, og dannelse af metastase til lungen. Ud over en række slutpunkter, denne model giver et billede af en celler evnen til at invadere og undslippe primære organ, ind og overleve i kredsløbssystemet, og implantatet og vokse i et andet sted. Denne model er blevet brugt effektivt til at måle metastatisksvar på både ændringer i proteinekspression samt reaktion småmolekyle på kort ekspeditionstid.
Prostatakræft (PCA) er den mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd, og den anden hyppigste årsag til kræft dødsfald i USA 1.. Døden fra PCa ikke skyldes dannelsen af den primære tumor, men dannelsen af metastaser. Derfor forebyggelse af metastaser hos patienter er af stor betydning. Musemodeller af PCa tilbyde en mangfoldighed af muligheder for at afdække kritiske biologiske oplysninger om denne sygdom.
En række musemodeller af PCa eksisterer, hver med iboende fordele og begrænsninger. Mens hyppigheden af PCa hos mennesker er høj, naturligt forekommende PCa er uhyre sjælden i mus 2, på trods af lige modtagelighed mus samlet til kræft 3.. En gnaver undtagelse er udvikling af PCa i Lobund Wistar rotter, som kan opnå satser PCa på 90% ved 12 måneder via induktion af methylnitrosourea og testosteron 4.. Af denne grund, induceret modelsystemer, såsom TRAMP(Transgene adenocarcinom musen prostata) model er almindeligt anvendt. Vagabonden modellen kan fremkalde transgen ekspression specifikt i prostata, og gennemgår den normale progression af PCA fra hyperplasi til prostata intraepitelialneoplasi (PIN) til lymfe-og lunge metastase 5-6. Disse modeller giver fordelene ved at være i stand til at måle det fulde spektrum af tumorudvikling, samt indeholder et intakt immunsystem. De molekylære begivenheder, der ligger til grund PCa udvikling kan dog variere mellem mus og mennesker, og korrelationer mellem mus og humane kliniske undersøgelser har vist variabilitet. Derudover begge disse modeller, er tidskrævende, som et eksempel TRAMP model kræver cirka 28 uger for at udvikle metastaser.
Ved at studere metastaser er ofte en hale-vene eller venstre ventrikel injektion anvendte model. Denne model har gavn af hurtig ekspeditionstid, og kan desuden måle tilstedeværelsen af knogle metastaser ved hjælp af specifikke cellelinier og betingelser. Yang et al. Har rapporteret, at subkutan injektion af GFP-positive PC3 celler kan forårsage udbredes knoglemetastaser 7 og hale vene og intercardiac indsprøjtninger har også genereret knoglemetastaser udvikling 8-9. De store begrænsninger disse modeller vedrører manglen på en primær tumor bosiddende i prostata selv. Endvidere for modeller afhængige injektion af kræftceller i omløb, dette omgår hele første halvdel af metastatisk kaskade. Det udelukker dermed gennemgang af de indledende foranstaltninger, herunder invasion gennem den primære organ, der er biologisk vigtige foranstaltninger af metastatisk transformation. Mange regulatorer af metastatisk transformation påvirke invasion tidlig celle direkte. Tidlige trin i den metastatiske kaskade udgør højt prioriterede lokaliteter til terapeutisk målretning, som en gang kræftceller udbrede, klonal variation udvider kraftigt, og derved øge biologiskal mangfoldighed og aftagende effektiv terapeutisk målretning.
I et forsøg på at reagere på mange af de begrænsninger af disse modeller har vores laboratorium udviklet en orthotopisk model af human PCa, hvor den humane PCa PC3-M cellelinie implanteres direkte ind i prostata Balb / c athymiske mus. Efter 4-6 uger kan tumorstørrelse, tilstedeværelse af cirkulerende tumorceller (CTCs) og metastase til lungerne og lymfeknuder alle kvantificeres. Vi har faktisk brugt denne model til at evaluere effekten af 4 ',5,7-trihydroxyisoflavone (genistein) for at hæmme humane PCa metastase 10. Kosten forbrug af genistein har været forbundet med fald i prostata cancer metastaser og død 11-12, men tidligere ingen undersøgelse havde fastslået, om administration af genistein kan ændre PCa metastaser i dyr eller mennesker. I denne undersøgelse har vi vist, at behandling med genistein stærkt reduceret antallet af lunge metastase. Desuden har vi bestemt genistein alkert aktivering og ekspression af adskillige vigtige pro-metastatiske proteiner i den primære tumor, herunder fokal adhæsionkinase (FAK), p38 mitogen-aktiveret protein kinase (p38 MAPK), og varme shock protein 27 (Hsp27).
Disse resultater svarede til observationer i klinikken. Brug blod fra mus, var vi i stand til præcist at måle blodets koncentrationer af genistein og observeret disse at være magen til niveauet i mennesker med regelmæssig indtagelse af genistein gennem kosten. Derudover en fase II undersøgelse foretaget af vores gruppe besluttet, at ved behandling med genistein, mænd oplevede fald i prostata væv mRNA ekspression af gener, der er forbundet med cellulær invasion og metastasering, specielt matrixmetalloproteinaseaktivitet type 2 (MMP-2) 13..
Vi har også brugt denne model til at vurdere effekten af ændrede genprodukt-ekspression i den primære tumor på human PCa metastase 14. Tumor supprEssor endoglin er et medlem af TGF-superfamilien og undertrykker humane PCa cellulær invasion in vitro via ændring af Smad signalering 15. Vi har udvidet disse undersøgelser for at bestemme effekten af endoglin på human PCa metastaser. Stabil endoglin knockdown, vektor kontrol eller endoglin overekspression cellelinier blev implanteret i mus. Endoglin knockdown celler viste det højeste antal lunge metastase samt CTCs i 38% af musene. Mus implanteret med kontrol vektor viste en middelsvær reaktion med mindre lunge metastase pr mus og CTCs i kun 18% af musene. Høj endoglin implanterede mus viste næsten fuldstændig undertrykkelse af lunge metastase, og fuldstændig undertrykkelse af CTCs.
Disse er blot to eksempler på den brede vifte af anvendelser af denne teknik har. Fra lægemiddelforskning, denne model til modellering ændringer i molekylær biologi, tilbyder en high throughput metode til vurdering af virkningerne af de forskellige funktioner på tumorvækst og muldvarpcular ændringer tilstedeværelse af CTCs, og dannelse af særskilte metastaser i lunge-og lymfeknuder.
I dette papir tilvejebringer vi en hidtil ukendt murin model af human PCa metastaser. I denne model er den menneskelige PCa cellelinier PC3-M orthotopisk implanteres direkte ind i prostata Balb / c athymiske mus og tumorerne lades udvikle sig i 4-6 uger. I det repræsentative resultater sektion, viser vi eksempler på data, der kan indsamles, herunder mus vægt og fødeindtagelse, tumor størrelse og vægt, molekylære karakteristika tumor, og dannelse af særskilte metastaser til lungerne. Derudover kan en bred vifte af ekstra udgange undersøges alt efter de særlige forskningsmæssige interesser. Et eksempel er tilstedeværelsen af CTCs til blod og knoglemarv. Som CTCs er en relativt sjælden begivenhed (vi observerer CTCs i ca 5-20% af kontroldyr), vi var ikke overrasket over, at ingen af de fem mus i disse forsøg udviklede CTCs. Vores laboratorium har også brugt denne model til at bestemme ændringer i cellulær adhæsion ved at måle nukleare celle morfologi iprostatavæv 10. Vi har også brugt denne model til at vurdere primær tumor spredning og apoptose status ved hjælp af Ki67 og TUNEL farvning af prostata tumor 14.
Ud over den brede vifte af dataudgangssignaler, der kan opnås, kan denne model anvendes til at bestemme virkningerne af både ændringer i proteinekspression samt småmolekyle. Sammenlignet med mange spontane og inducerede modeller af human PCa metastase, der er en højere behandlingstid på kun 4-6 uger. Andre modeller med en høj ekspeditionstid, såsom hale vene eller intercardiac injektion modeller, har begrænsninger af nogen primær tumor, og dermed ikke fuldt ud opridset klinikken metastatisk kaskade. I vores model, skal tumorceller undslippe det primære sted for oprindelse, indtaste og overleve kredsløbssygdomme, og implantatet i et sekundært site. Dette giver yderligere trin, hvor en terapeutisk intervention eller ændring i protein-ekspression kan levere en effekt. Additionelt, skal tilstedeværelsen af den primære tumor giver mulighed for nem anvendelse af denne model til nye imaging teknologier såsom luciferase-baserede IVIS 16-17.
På trods af den brede vifte af fordele ved denne model, er der også flere begrænsninger til at overveje. Et stigende antal undersøgelser viser vigtigheden af immunsystemet i tumormikromiljøet og udvikling af metastaser 18. I denne model, på grund af brugen af et athymiske gnaver, evnen til at vurdere virkningerne af immunsystemet er ikke mulig. En anden begrænsning er den manglende androgen reaktionsevne i PC3-M-celler. Ved første diagnose af PCa patienter ofte vil gennemgå androgen terapi som en første linje behandling. Imidlertid vil patienterne i sidste ende blive androgen-resistente og tumorer vil begynde at vokse igen. Som PC3-M celler mangler androgenreceptoren, kun denne model måler effekten af medicinsk behandling eller protein graduering på post-androgen resistente cancer. Selvom dette er en begrænsning, androgen-responsiv PCa er i øjeblikket godt overskueligt og har en bred vifte af effektive behandlingsmuligheder, og dermed androgen-resistent kræft er blevet mere fremtrædende undersøgt. Denne model også specifikt anvender en indavlet stamme af mus, hvilket minimerer musen til variabilitet mus. Dog kan denne stamme være særligt lydhøre over for bestemte proteiner eller små molekyler, og dermed skal sørges når ekstrapolere disse data til klinikken.
Selvom denne model giver en effektiv måling af lægemiddeleffektivitet i en hurtig ekspeditionstid af 4-6 uger, kan dette ikke tage hensyn til langsigtede doseringen virkninger. Efter langvarig udsættelse for mange aktuelt tilgængelige behandlinger, kan patienterne vende tilbage med resistente kræft mange år efter behandlingen. Den hurtige vending af denne teknik ikke mulighed for effektiv modellering af evnen af en tumor for at blive resistente over for behandling. Men med modulering af denne exeksperiment, kan behandlingsresistente humane prostatacancerceller implanteres, og effektiviteten af en anden generation terapeutisk forebygge PCa tumorvækst og metastasering kan modelleres. Desuden, hvis en gruppe forsøgte at studere de molekylære forandringer i en primær tumor over tid, en langsigtet model, såsom TRAMP model vil sandsynligvis være mere effektiv for disse undersøgelser.
En anden begrænsning ved denne model er formidling af særskilte metastase kun lymfeknuder og lunger af dyr. Begge disse steder er hyppige og klinisk relevante steder af metastase, som påvist af menneskelige varme obduktion undersøgelser 19. Men klinisk knoglemetastaser udgør et fremtrædende træk ved menneskets PCa og dermed modellerne opridset dette er af interesse. Desværre er disse svære at rekapitulere i en musemodel, med meget få modeller, der viser knoglemetastaser uden hale vene, intercardial injektion eller direkte implantation itil benet 20.. Således hvis målretning til benet er af central eksperimentel betydning, kan en anden model være mere effektive. Men denne model giver en vis grad af trafik til knoglen i form af knoglemarv cirkulerende tumorceller.
Trods disse begrænsninger, denne teknik er en kraftfuld model af human PSA. Evnen til at måle virkninger på både den primære tumor samt metastatisk dannelse i en kort ekspeditionstid giver en bred vifte af anvendelser. I denne model, celler undslippe det primære organ, ind og overleve i blodbanen, og implantatet i et andet sted, idet den gentog processen i mennesker. Den ekstra måling af molekylære karakteristika den primære tumor, ændringer i celle morfologi, og tilstedeværelse af cirkulerende tumorceller giver en bred pust af oplysninger fra én model. Denne procedure kan anvendes både i forbindelse med lægemiddeludvikling, samt at studere ændringer i tumor biologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) til RCB, CA122985 og prostata SPORE CA90386 og til JMP, NIH T32 AG000260 "Drug Discovery Træning i aldersrelaterede sygdomme", og af Walter S. og Lucienne Driskill Graduate Program i Biovidenskabelige Fakultet ved Northwestern University. Vi vil også gerne takke Mouse Fænotype og Histologi Laboratory og Patologi Core Facility ved Northwestern University.
Equipment | |||
1 ml Syringe, Tuberculin, Slip-Tip | Becton Dickinson | 309659 | |
23 G 3/4 Precison Glide Needle | Becton Dickinson | 305143 | |
30 G 1/2 Precision Glide Needle | Becton Dickinson | 305106 | |
Alcohol Wipes | Triad | 10-3001 | |
Autoclip Applier, 9mm, Stainless Steel | Becton Dickinson | 427630 | |
Clips, 9mm | VWR | 15431-673 | |
Convertors Polyline Towel (Sterile) | Cardinal Health | 3520 | |
Cotton-Tipped Applicators, 6 inch, Sterile, Wooden Shaft | Fisher | 23-400-125 | |
Curad Sterile Cotton Balls | VWR | 500043-544 | |
Derf Needle Holder, Integra Miltex, 121 mm (4 3/4″) | VWR | 95039-192 | |
Duraprene SMT Sterile Neoprene Powder-Free Surgical Gloves | Cardinal Health | 2D72PN70 | |
Germinator 500 | Cell Point Scientific | SN 7030 | |
Kendall Monojet Needles, 1/2 cc syringe with permanent 28 G 1/2 needle | Tyco | 1180528012 | |
Medium Heating Pad | VWR | 100229-094 | |
Merit Iris Scissors, Sklar, 11.4 cm (4 1/2″) | VWR | 94000-000 | |
Metric/English Vernier Caliper | VWR | 19155-057 | |
PDS*11 Violet Monofilament Sutcher 4-0, 27″ | Ethicon | Z304H | |
VetEquip Inhalation Anesthesia System | Contact Your Animal Facility for Availability | ||
VWR Premium Tissue Cassettes | VWR | 18000-010 | |
VWR Specimen Forceps, Serrated, Straight, 114 mm (4 1/2″) | VWR | 82027-440 | |
Reagents | |||
Betadine Surgical Scrub | Fisher Healthcare | 19-027132 | |
Buprenex | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
Dako DAB + Chromagen | Dako | K3468 | |
Dako Envision + System HRP-Labeled Polymer, Anti-Rabbit | Dako | K4003 | |
Dako Envision Kit Protein Block | Dako | X0909 | |
Formalin | VWR | 95042-908 | |
GFP Antibody | Invitrogen | A11122 | |
Hematoxylin | Mayer | MH580-2.5L | |
Meloxican | Obtain from Animal Facility | ||
Nembutal | Controlled Substance – Obtain from Animal Facility | ||
Rneasy RNA Isolation Kit | Qiagen | 74104 | |
Sterile Saline | Obtain from Animal Facility | ||
Taqman Reverse Transcription Reagents | Life Technologies | N8080234 | |
TaqMan Universal PCR Master Mix | Life Technologies | 4304437 | |
Trizol | Invitrogen | 10296 |