人类前列腺癌转移的原位小鼠模型

对于涉及动物的所有程序，协议获得批准的机构动物护理和使用委员会（IACUC）在西北大学。手术技术和动物保健条件由兽医人员进行了观察和修改，以尽量减少动物的紧张和死亡率。个别机构可能有不同的要求，并与IACUC和动物的工作人员制定和执行这种手术方法时，工作是很重要的。 1。细胞注射液的制备这一步应该进行尽可能接近到开始手术。胰蛋白酶消化细胞被用于该实验中，从板取下，并用中和介质。的PC3-M人类前列腺癌细胞株稳定转染GFP已经被成功地用于这些实验中，由于PC3-M细胞的快速生长的条件。 GFP加入额外的易用性检测肺组织样本，与快速测定肺转移的癌细胞与从血液和骨髓，以确定循环肿瘤细胞中获得的免疫细胞在培养物。如果修改的感兴趣的特定基因，然后建立稳定的细胞系与该基因改造的首先执行，然后转染GFP。如果GFP将改变感兴趣的该基因的功能，GFP它可以省略。这将使检测肺转移比较困难，但还是可以实现的。此外，如果使用特定的成像技术使用荧光标记物，如荧光素酶为基础的IVIS，可以使用其它荧光蛋白代替。 离心5分钟，在225×g的。 分离2.5×10 5个细胞，并离心5分钟，在225×g下。 在20微升无菌盐水除去上清，重悬细胞。 吸出细胞悬液加入0.5 ml注射器具有永久28½号针头（推荐：肯德尔MONOJET，其他品牌造成的问题），确保没有空气进入针人翁的悬浮液。 注射器包装在无菌铝箔和冰上储存直至使用。 2。人类前列腺癌细胞原位移植雄性6-8周龄的BALB / c无胸腺小鼠的使用。理想的小鼠体重的手术是19-21克，和鼠标应该被允许在手术前将增长到至少有18克小动物在技术上比较难操作的。较大的动物往往会遇到较慢的肿瘤生长和转移的动力学。动物应该被安置在至少一个星期在手术前，尽量减少动物应激的动物设施。根据实验设计，药物治疗可能1周开始在手术前。 根据动物设施的指示，注射手术前的止痛药。使用连接到1毫升注射器30½号针头0.1毫克/千克体重皮下注射BUPRENEX建议。 将动物进入异氟醚室，等到动物是完全一nesthetized。肌张力无趾反射应该出席了这一点。建议使用此方法，但如果无法使用，麻醉等方法可以根据动物设施的使用说明书操作。 移动动物出来的异氟烷室的进入无菌程序罩。将动物入鼻锥设备，并重新确保动物是在全麻醉，然后再继续。 用优碘擦洗消毒棉球消毒下腹部区域，用酒精擦拭擦拭，并用聚维酮碘溶液最终喷雾。晾干。 无论是使用消毒的手术刀或削尖的无菌手术剪，约3-4毫米低中线腹部切口而成。使用镊子轻轻提起膀胱和识别前列腺腹叶。这两个波瓣位于膀胱正下方。有些鼠标将有一个小的脂肪层覆盖，可轻轻移动一边用消毒棉签前列腺。 Minimiz机关电子所有的运动和肌肉组织，如果可能的。 注入20微升体积的细胞溶液进入前列腺，最大限度地减少泄漏，并确保小泡被观察到。 更换膀胱和使用4.0薇乔可吸收缝合线的单丝在一个简单的中断模式关闭肌肉层。 使用无菌9毫米钉合皮肤层。 从异氟醚麻醉取出动物和监控，直到清醒和正常转动。在恢复期放置在加热垫。 如果多次手术正在执行，手术，清洁所有工具之间用70％的乙醇，并用消毒的玻璃珠灭菌。让工具下的动物在充分冷却。请勿重复使用缝线，棉球或无菌拭子。 3。监测动物基于动物设施的指示管理止痛药。皮下美洛昔康的一剂4小时手术后施用1毫克/千克体重ü唱连接到1毫升注射器30½号针头，建议，由一个附加的剂量为每12-24小时在未来48小时。 史泰博可以从动物7-10天手术后取出，一旦伤口愈合。 监测动物体重，摄食量，和触诊老鼠的肿瘤，每周两次，直至终止实验。增加频率可达每一天，当肿瘤变成可见的检查下显著肿瘤负荷或胁迫的动物。早期死亡从这个模型是由于大的原发肿瘤的负担，因为原发肿瘤可以阻止尿流，因此具有大于15％的体重，或原发肿瘤达到直径为1.5厘米的损耗的任何动物，应立即进行尸体剖检，以防止尿路梗阻和动物死亡。 监测需要对动物环境的进一步浓缩。手术的压力增加动物的明争暗斗。而不是一个和其他行为增加了两个塑料小屋每笼人的富集可以减少这些事件。讨论与可在动物被安置在该设施的兽医工作人员的选择。由于缺乏对这个品系小鼠的睫毛，小屋和富集纸做的，不推荐，因为它们会刺激眼睛。 4。剖检程序 4-6周后，肿瘤完全明显，动物开始减肥，由于增加肿瘤负荷。肿瘤通常可触诊和/或在视觉上是明显的。尸体剖检应在此时进行。在使用连接到1毫升注射器30½针头260毫克/公斤体重进行腹腔注射戊巴比妥，并让动物成为完全无意识，无趾反射或肌张力存在。 一旦动物被麻醉，用无​​菌手术剪刀或手术刀，剪水平穿过直接在左肋动物的躯体，然后垂直地沿着动物的侧腋下，暴露心脏。执行使用连接到1毫升注射器用4％枸橼酸钠的DPBS冲洗，防止凝血，获得尽可能多的血液尽可能从动物30½号针头终端心脏穿刺。 通过切割气管手术剪刀或手术刀从动物取出肺，并立即放置到组织培养盒和在10％福尔马林中。 通过单独地切断附连到任何肿瘤的血管并确保没有额外的器官如输精管或精囊从动物取出原发性前列腺肿瘤相连。 记录肿瘤的重量和体积。测量肿瘤的重量在以实验室规模克。用卡尺测量肿瘤的以厘米为单位的最长径的长度，以及相应的垂直轴。乘这些值来获得肿瘤的大小。根据不同的使用目的，马上急速冷冻在液氮中，和/或地方到组织盒放入10％福尔马林。 暴露髋关节和膝关节手术剪刀或手术刀，并断开腿关节，注意要保持股骨完好。从动物中取出股骨并放入无菌盐水。 取得任何其他器官或感兴趣的材料，并根据您的机构的指示处置动物。特别地，区域淋巴结往往有转移，往往如果窝藏它们被放大，并且可以收获。然而，应该注意，因为这可能会受到所引起的外科手术过程中的变化的静水压力。 5。加工和肺组织免疫染色样品在24-48小时将组织成PBS中10％的甲醛，嵌入肺石蜡。 第肺部在45微米步路段，采取2-3个相邻的4微米的肺组织切片。 如果使用GFP阳性细胞（推荐），进行免疫染色绿色荧光蛋白。如果没有，执行标准苏木精和曙红（H＆E）染色。 注：Dako公司设想+套件结合来自Invitrogen的GFP抗体已成功地用于根据制造商的说明，但是这可以被修改为任何免疫程序。 以盲分数转移。如果GFP阳性，肿瘤细胞会弄脏褐色除了拥有庞大而独特的细胞核。当第一次得分转移，咨询病理学家，以确保正确的得分，并用H＆E染色的肺组织，以确认肿瘤细胞的存在，并没有浸润的免疫细胞。 6。从血液和骨髓循环肿瘤细胞的识别添加从尸检收集到1.5 ml离心管中所有的血。离心5分钟，在800×g的。 去除血浆和加入1 ml的ACK裂解缓冲液（154.95毫米氯化铵，9.99毫米钾Bicarbo内特，0.0995毫米EDTA）。让血液在室温下放置3-5分钟。 离心5分钟，在800×g的。 去除上清，加入1 ml含抗生素的细胞培养基。加细胞含有9毫升细胞培养基的T75烧瓶中。 培养细胞在37℃，在含5％CO 2中培养10天，检查的CTC的存在下，每2-3天的潮湿气氛中。 对骨髓，从使用剪刀，刀片或手术刀股骨移除所有的肌肉组织。除去骨的端部，尽可能靠近端部尽可能。 使用23¾号针头，轻轻弹出骨髓从股骨到1.5ml的离心管中。 添加到1ml细胞培养基，并轻轻吸取良好混合。 加细胞含有9毫升细胞培养基的T75烧瓶中。 7。肿瘤的分子特征用于聚合酶链式反应（PCR）测定秒，肿瘤样品是快速冷冻在液氮中首先被粉碎的干冰上，然后使用组织匀浆3-5分钟，用1ml TRIzol试剂均化。的TRIzol提取是根据制造商的说明书进行。根据制造商的说明使用RNeasy RNA提取试剂盒纯化的RNA。进行cDNA的合成和定量实时根据制造商的说明书，使用TaqMan试剂PCR（定量RT / PCR）的建议，但是可以修改为任何目前使用的PCR方法。 对于Western印迹分析，使用组织匀浆3-5分钟用1ml裂解缓冲液中匀化组织：PBS（137 mM氯化钠，10mM的磷酸钠，2.7毫米氯化钾），0.5％的Triton X-100，1mM EDTA中，的2.5mM焦磷酸钠，1mM的β-磷酸甘油，并加入蛋白酶抑制剂混合物，磷酸酶抑制剂鸡尾酒2和3，10mM的氟化钠，和1mM原钒酸钠。细胞裂解物混合物置于1.5毫升离心管中。 一分钱rifuge细胞裂解液混合物在13,000×g的10分钟。 除去上清液并置于一个新的1.5毫升离心管中，以13,000×g下再离心10分钟。如果细胞碎片仍然存在，另外的离心步骤可以被执行。 除去上清液，进行蛋白质印迹按正常的实验室条件。