Измерение общего кальция в нейронах помощью электронно-зондового рентгеновского микроанализа
Summary
Эта статья описывает применение cryoanalytical электронной микроскопии для количественного определения общего содержания кальция и распространения на субклеточном резолюции в физиологически определенных биологических образцов.
Abstract
В этой статье инструменты, методы и инструменты, подходящие для количественных измерений внутриклеточного содержания элементов с помощью метода, известного как электронно-зондового микроанализа (EPMA) описаны. Внутримитохондриальной кальция является особое внимание в связи с важной ролью, что митохондриальная перегрузки кальция играет в нейродегенеративных заболеваний. Метод основан на анализе рентгеновских лучей, генерируемого с помощью электронного микроскопа (ЭМ) при взаимодействии электронного пучка с образцом. В целях сохранения нативного распределение диффундирующих элементов в микроскопии образцов электрона, EPMA требует "cryofixation" из ткани с последующим подготовки ультратонких криосрезов. Быстрое замораживание культивируемых клеток или органотипических культур срез осуществляется путем погружения замораживания в жидком этана или шлема замораживания против холодного металлического блока, соответственно. Криосрезы номинально 80 нм обрезаются сухие с алмазным ножом на ок. -16076, С, установленный на углерод / pioloform покрытием медных сетей, и cryotransferred в крио-ЭМ, используя специализированный держатель cryospecimen. После визуального осмотра и отображения местоположения на ≤ -160 ° С и низкой дозы электронов, замороженные гидратированных криосрезы лиофилизируют при -100 ° С в течение ~ 30 мин. Изображения на уровне органелл высушенных криосрезов записаны, также в низкой дозе, с помощью ПЗС-камеры медленного сканирования и субклеточных регионах, представляющих интерес, выбранной для анализа. Рентгеновские лучи, испускаемые трансформирования стационарным, целенаправленной, высокой интенсивности электронного зонда собирают энергии-рентгеновской (EDX) спектрометра, обрабатывается, связанных электроники, и представлены в качестве рентгеновском спектре, то есть, Сюжет интенсивности рентгеновского излучения по сравнению энергии. Дополнительное ПО облегчает: 1) идентификацию элементарных компонентов по их "характерных" пиковых энергий и отпечатков пальцев, и 2) количественный анализ по добыче пиков / фон. Эта статья завершается двумя примерами, которые иллюстрируют типичныйПриложений EPMA, в котором митохондриальный анализ кальций обеспечивает необходимую понимание механизмов эксайтотоксичного травмы и другой, которые показали основе устойчивости к ишемии.
Introduction
Ионы кальция, возможно, наиболее важным и универсальным лицо клеточной сигнализации в биологии, играя важную роль в нормальных процессов как разнообразны, как и синаптической передачи и экспрессии генов. С другой стороны, кальций не менее важно в гибели клеток. В частности, дерегулирование кальция является ключевым фактором в нейронной травмы при инсульте, болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера и других нейродегенеративных заболеваний 3,5. Таким образом, крайне важно, чтобы количественно понять, как кальций распределяется в клетках, и как это меняет следующие физиологических или патофизиологических раздражители. Эта цель осложняется тем, что кальций динамически распределяется между двумя физическими состояниями – бесплатно в растворе или связанного с подложкой – и что концентрации сотовой кальция меняться с течением несколько порядков, как следствие стимуляции.
Хотя Есть несколько передовых методологий, имеющихся для анализа фри ее внутриклеточный кальций, определение общей концентрации кальция в определенных внутриклеточных отсеков реально ограничивается одним подхода, а именно, зондовый микроанализ электронов (EPMA). EPMA является метод, который пары рентгеновский спектрометр для просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ). ТЕМ электронная пушка фокусируется стационарный, субмикронного электронный зонд на субклеточном интересующей области и элементов конкретных рентгеновского излучения в результате электронной бомбардировки собираются и анализируются (см. ссылки 7, 4 для подробных технических обзоров). Преимущества EPMA включают одной резолюции органелл уровня и submillimolar чувствительность. На практике, однако, EPMA требует специализированных cryotechniques и аппаратуры для подготовки и анализа образцов. Здесь инструменты, методы и инструменты, подходящие для измерения внутриклеточного кальция с использованием ЭЗМА описаны. Внутримитохондриальной кальция представляет особый Iпроценты в связи с важной роли, которую играет митохондриальные перегрузки кальция в нейродегенеративных заболеваний.
Protocol
Representative Results
Discussion
Электронный микроскоп на основе аналитический метод, представленный здесь позволяет для обнаружения, идентификации и количественного определения нескольких элементов биологический интерес, в том числе Na, K, P, и особенно Са. Эти анализы могут проводиться на субклеточном, т.е. внут?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить г-жу Кристин А. Уинтерс за отличную техническую помощь. Эта работа была поддержана Basic Neuroscience Программе исследовательской программы NINDS Интрамурального, NIH (Z01 NS002610).
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|
Referências
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens. Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).
- Aronova, M. A., Leapman, R. D. Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology. Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).
- Bezprozvanny, I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).
- Fernandez-Segura, E., Warley, A. Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology. Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).
- Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology. Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).
- Newbury, D. E. The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector. Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).
- Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections. J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).
- Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).
- Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).
- Ritchie, N. W. Spectrum simulation in DTSA-II. Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).
- Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons. Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr. J. Microsc. 216, 76-83 (2004).
