Summary

Microfluïdische On-chip Capture-cycloadditiereactie omkeerbaar Immobiliseer Small Molecules of Multi-component Structuren voor biosensortoepassingen

Published: September 23, 2013
doi:

Summary

We presenteren een methode voor een snelle, omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen en gefunctionaliseerde nanodeeltjes assemblages voor Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, met behulp van sequentiële on-chip bioorthogonal cycloadditiereactie chemie en antilichaam-antigen capture.

Abstract

Methodes voor snelle oppervlakte immobilisatie van bioactieve kleine moleculen met controle over de oriëntatie en immobilisatie dichtheid zijn zeer wenselijk voor biosensor en microarray toepassingen. In deze studie, gebruiken we een zeer efficiënte covalente bioorthogonal [4 +2] cycloadditie reactie tussen trans-cyclo (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) de microfluïdische immobilisatie van TCO / Tz-gederivatiseerde moleculen inschakelen . We volgen het in real time onder continue stroomomstandigheden behulp van oppervlakte-plasmon resonantie (SPR). Omkeerbare immobilisatie inschakelen en verlengen de experimentele bereik van het sensoroppervlak combineren we een niet-covalente antigeen-antilichaam koolstofafvangcomponent de cycloadditiereactie. Door afwisselend presenteren TCO of Tz groepen aan het sensoroppervlak, verschillende capture-cycloadditie processen nu mogelijk aan een sensoroppervlak voor on-chip montage en interactie studies van een groot aantal multi-component structuren. We illustrate deze methode met twee verschillende experimenten immobilisatie op een biosensor chip, een klein molecuul, dat AP1497-FK506 bindend eiwit 12 (FKBP12) bindt, en dezelfde kleine moleculen als deel van een geïmmobiliseerd en in situ gefunctionaliseerde nanodeeltjes.

Introduction

Efficiënte conjugatiereacties zijn waardevolle hulpmiddelen voor het bevestigen van bioactieve moleculen aan oppervlakken voor diverse biotechnologische toepassingen. Onlangs heeft de zeer snelle bioorthogonal [4 +2] cycloadditiereactie tussen trans-cycloocteen (TCO) en 1,2,4,5-tetrazine (Tz) gebruikt om celoppervlak, subcellulaire structuren, antilichamen en nanodeeltjes label 1. – 7 Hier gebruiken we de [4 +2] cycloadditie reactie in combinatie met antigen / antilichaam-capture (GST / anti-GST) voor wisselbaar-chip synthese van multi-component structuren Surface Plasmon Resonance (SPR) interactie analyse en bewaken van de proces in real-time (figuur 1). 8,9 name de capture-cycloadditie strategie maakt oppervlak regeneratie met behulp van een vooraf vastgesteld protocol. 8 Als gevolg, assemblage van stabiele sensor oppervlakken met controle over ligand oriëntatie en dichtheid voor tal van nieuwe assay formaten is nu mogelijk. Gebruikdeze strategie laten we de immobilisatie van TCO / Tz-gederivatiseerde kleine moleculen karakteriseren cycloadditie prijzen in verschillende buffer omstandigheden. We kozen voor het bekende interactie tussen FKBP12 en een molecuul AP1497 dat FKBP12 10-12 bindt als een voorbeeld om na te gaan of de capture-cycloadditie strategie behoudt het vermogen van de kleine molecule om te communiceren met de doelgroep wanneer hetzij rechtstreeks aangesloten op geïmmobiliseerde GST antigenen of aan geïmmobiliseerd nanodeeltjes (NP).

Deze methode biedt een aantal voordelen. Ten eerste, de omkeerbare immobilisatie van kleine moleculen op sensorchips is nu mogelijk. Ten tweede, TCO / Tz immobilisatie van kleine moleculen maakt ook label-free interactiestudies dat de oriëntatie van canonieke SPR studies te keren, en kunnen een aanvullende weergave van een bindende interactie. Ten derde, deze methode kan de microfluïdische synthese van gerichte nanodeeltjes en onmiddellijke evaluatie van de binding eigenschappen. Dit belooft de efficiëntie te evalueren of screenen gericht nanoparticles verbeteren en tevens de hoeveelheid nanodeeltjes vereist verminderen. 13-15 vierde kan deze benadering de reactiekinetiek van bioorthogonal cycloadditiereacties meten realtime onder continue stroom. Ten slotte TCO / Tz immobilisatie chemie is robuust in aanwezigheid van serum. Samengevat, verwachten we dat deze veelzijdige benadering constructie van stabiele sensor oppervlakken uiteenlopende microfluïdische studies relevante in vitro pt in vivo cellulaire toepassingen algemeen zal vergemakkelijken.

Protocol

1. Voorbereiding van GST en Nanoparticle (NP) Stamverwanten GST-TCO voorbereiding: Voeg 8 ul van TCO-NHS-oplossing (50 mM in DMSO) en 100 gl GST (1 mg / ml in PBS) en schud het mengsel bij kamertemperatuur gedurende 1 uur. Verwijder overtollig reagens met een Zeba draai ontzoutingskolom. Het gewonnen filtraat dat het GST-TCO conjugaat wordt bewaard bij 4 ° C vóór gebruik. GST-Tz voorbereiding: Voeg 6 pl Tz-NHS-oplossing (25 mM in DMF) 75 gl GST (1 mg / ml in …

Representative Results

Gegevens en cijfers zijn op basis van referentie 8. Efficiënte omkeerbare immobilisatie van biologisch werkzame kleine moleculen met controle over de oriëntatie en dichtheid speelt een belangrijke rol in de ontwikkeling van nieuwe biosensor toepassingen. De snelle bioorthogonal reactie tussen TCO en Tz beschrijven we een werkwijze voor de stapsgewijze assemblage en regeneratie van ligand oppervlakken met behoud van biologische activiteit. Figuur 2 toont de real-time monito…

Discussion

De capture-cycloadditiereactie hier beschreven methode maakt een snelle, omkeerbare immobilisatie van gemodificeerde nanodeeltjes en kleine moleculen voor label-free-chip gebaseerde interactie en kinetische studies. De immobilisatie protocol kan worden uitgevoerd minuten ter <10 uM concentratie van kleine moleculen liganden. Door het moduleren van ligand concentratie en contacttijd immobilisatie dichtheden nauwkeurig kan worden gecontroleerd. Onze gegevens tonen aan dat on-chip bioorthogonal reacties behoud van de mo…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wij erkennen financiering van NIH (NHLBI Contract No HHSN268201000044C naar RW, SH en SYS).

Materials

Reagent
Sensor Chip CM5 GE Healthcare BR-1005-30
Amine coupling kit GE Healthcare BR-1000-50
GST capture kit GE Healthcare BR-1002-23
NAP-10 Columns GE Healthcare 17-0854-01
GST, lyophilized in 1X PBS Genscript Z02039 1 mg/ml
rhFKBP12 R&D Systems 3777-FK
Surfactant P-20 GE Healthcare BR-1000-54
Glycine 2.0 GE Healthcare BR-1003-55
Zeba spin desalting column Thermo 89882 7 K MWCO
Amicon Ultra 4 Fisher UFC810096 100 K centrifugal filter
TCO-OH Ref. 8 Synthesized in-house
TCO-NHS Ref. 8 Synthesized in-house, *Commercially available from Click Chemistry Tools # 1016-25
Tz-BnNH2 Ref. 8 Synthesized in-house
Tz-NHS Ref. 8 764701 Synthesized in-house, *Commercially available from Sigma Aldrich # 764701
NP-NH2 = CLIO-NH2 Ref. 8 Synthesized in-house
AP1497, AP1497-Tz Ref. 8 Synthesized in-house
Equipment
SPR Biosensor GE Healthcare Biacore T100

Referências

  1. Devaraj, N. K., Upadhyay, R., Haun, J. B., Hilderbrand, S. A., Weissleder, R. Fast and sensitive pretargeted labeling of cancer cells through a tetrazine/trans-cyclooctene cycloaddition. Angew Chem Int Ed Engl. 48, 7013-7016 (2009).
  2. Seitchik, J. L., et al. Genetically encoded tetrazine amino acid directs rapid site-specific in vivo bioorthogonal ligation with trans-cyclooctenes. J Am Chem Soc. 134, 2898-2901 (2012).
  3. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Marinelli, B. S., Lee, H., Weissleder, R. Probing intracellular biomarkers and mediators of cell activation using nanosensors and bioorthogonal chemistry. ACS Nano. 5, 3204-3213 (2011).
  4. Budin, G., Yang, K. S., Reiner, T., Weissleder, R. Bioorthogonal probes for polo-like kinase 1 imaging and quantification. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 9378-9381 (2011).
  5. Liu, D. S., Tangpeerachaikul, A., Selvaraj, R., Taylor, M. T., Fox, J. M., Ting, A. Y. Diels-Alder cycloaddition for fluorophore targeting to specific proteins inside living cells. J Am Chem Soc. 134, 792-795 (2012).
  6. Haun, J. B., Devaraj, N. K., Hilderbrand, S. A., Lee, H., Weissleder, R. Bioorthogonal chemistry amplifies nanoparticle binding and enhances the sensitivity of cell detection. Nat Nanotechnol. 5, 660-665 (2010).
  7. Liong, M., et al. Specific pathogen detection using bioorthogonal chemistry and diagnostic magnetic resonance. Bioconjug Chem. 22, 2390-2394 (2011).
  8. Tassa, C., et al. On-chip bioorthogonal chemistry enables immobilization of in situ modified nanoparticles and small molecules for label-free monitoring of protein binding and reaction kinetics. Lab Chip. 12, 3103-3110 (2012).
  9. Pol, E. The importance of correct protein concentration for kinetics and affinity determination in structure-function analysis. J Vis Exp. (37), e1746 (2010).
  10. MacBeath, G., Schreiber, S. L. Printing proteins as microarrays for high-throughput function determination. Science. 289, 1760-1763 (2000).
  11. Ong, S. E., et al. Identifying the proteins to which small-molecule probes and drugs bind in cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4617-4622 (2009).
  12. Tassa, C., et al. Binding affinity and kinetic analysis of targeted small molecule-modified nanoparticles. Bioconjug Chem. 21, 14-19 (2010).
  13. Weissleder, R., Kelly, K., Sun, E. Y., Shtatland, T., Josephson, L. Cell-specific targeting of nanoparticles by multivalent attachment of small molecules. Nat Biotechnol. 23, 1418-1423 (2005).
  14. Yuan, J., Oliver, R., Aguilar, M. I., Wu, Y. Surface plasmon resonance assay for chloramphenicol. Anal Chem. 80, 8329-8333 (2008).
  15. Myung, J. H., Gajjar, K. A., Saric, J., Eddington, D. T., Hong, S. Dendrimer-mediated multivalent binding for the enhanced capture of tumor cells. Angew Chem Int Ed Engl. 50, 11769-11772 (2011).
  16. Keelan, J. A. Nanotoxicology: nanoparticles versus the placenta. Nat Nanotechnol. 6, 263-264 (2011).
  17. Lundqvist, M., Stigler, J., Elia, G., Lynch, I., Cedervall, T., Dawson, K. A. Nanoparticle size and surface properties determine the protein corona with possible implications for biological impacts. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 14265-14270 (2008).
  18. Lundqvist, M., et al. The evolution of the protein corona around nanoparticles: a test study. ACS Nano. 5, 7503-7509 (2011).
  19. Mammen, M., Choi, S. -. K., Whitesides, G. M. Polyvalent interactions in biological systems: implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors. Angew Chem Int Ed Engl. 37, 2754-2899 (1998).
  20. Kausaite-Minkstimiene, A., Ramanaviciene, A., Kirlyte, J., Ramanavicius, A. Comparative study of random and oriented antibody immobilization techniques on the binding capacity of immunosensor. Anal Chem. 82, 6401-6408 (2010).
  21. Arkin, M. R., Wells, J. A. Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: progressing towards the dream. Nat Rev Drug Discov. 3, 301-317 (2004).
  22. Giannetti, A. M., Koch, B. D., Browner, M. F. Surface plasmon resonance based assay for the detection and characterization of promiscuous inhibitors. J Med Chem. 51, 574-580 (2008).
  23. Kimple, A. J., Willard, F. S., Giguere, P. M., Johnston, C. A., Mocanu, V., Siderovski, D. P. The RGS protein inhibitor CCG-4986 is a covalent modifier of the RGS4 Galpha-interaction face. Biochim Biophys Acta. 1774, 1213-1220 (2007).
  24. GE Healthcare. . Biacore Sensor Surface Handbook BR-1005-71. , (2005).

Play Video

Citar este artigo
Tassa, C., Liong, M., Hilderbrand, S., Sandler, J. E., Reiner, T., Keliher, E. J., Weissleder, R., Shaw, S. Y. Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications. J. Vis. Exp. (79), e50772, doi:10.3791/50772 (2013).

View Video