Summary

Analisi immunoistochimica nel Sistema Nervoso Centrale e Periferico Rat linfa nodo del tessuto Sezioni

Published: November 14, 2016
doi:

Summary

We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.

Abstract

Immunoistochimica (IHC) prevede la visualizzazione di proteine ​​altamente specifiche, affidabile e attraente. corretta esecuzione e interpretazione di un etichette multicolori IHC-based è impegnativo, soprattutto se utilizzata per valutare interrelazioni tra proteine ​​bersaglio nel tessuto con un alto contenuto di grassi come il sistema nervoso centrale (CNS).

Il nostro protocollo rappresenta un perfezionamento della tecnica immunomarcatura serie particolarmente adeguato per il rilevamento di entrambe le proteine ​​strutturali e solubili nel ratto SNC e linfonodi periferici (LN) affetti da neuroinflammation. Tuttavia, con o senza ulteriori modifiche, il nostro protocollo potrebbe probabilmente essere utilizzato per il rilevamento di altri bersagli proteici correlati, anche in altri organi e specie che qui presentato.

Introduction

Nonostante l'utilizzo di tecnologie avanzate high-throughput analisi effettuate sul methylome, trascrittoma o addirittura a livello del proteoma, immunostaining rimane il golden standard per la rilevazione delle proteine ​​direttamente nel campione di tessuto, coltura cellulare o uno striscio di cellule. Rivelando il modello di localizzazione / distribuzione, immunoistochimica (IHC) può valutare i rapporti relativi e interrelazioni topografiche delle proteine ​​bersaglio, e anche indicare le loro attività biologiche. Pertanto, IHC è ampiamente utilizzata per scopi clinici e di ricerca, per esempio, per la diagnosi, valutazioni di trattamento, lo studio dei meccanismi della malattia, alterazioni funzionali e fenotipiche in modelli animali, ecc

In sostanza comprende l'istologia, patologia, biochimica e immunologia, IHC è notevolmente avanzato dal 1941, quando gli anticorpi fluorescente sono stati utilizzati per la prima volta ad identificare gli antigeni pneumococco nel tessuto infetto 1. Visualization di prodotti cellulari e componenti per IHC si basa sul legame degli anticorpi (ABS) per la loro specifica antigene (Ag). Oltre a utilizzare fluorofori contrassegnati anticorpi, le reazioni immunitarie possono anche essere visualizzati utilizzando enzimi come la perossidasi 2,3 o fosfatasi alcalina 4. Inoltre, anticorpi oro-tag colloidali 5 sono utilizzati per rilevare specifica interazione antigene-anticorpo sia microscopia ottica ed elettronica, mentre le etichette radioattivi vengono visualizzati mediante autoradiografia.

La reazione immunologica Ag-Ab può essere rilevato tramite metodi diretti e indiretti. Il metodo diretto è sostanzialmente più veloce e più semplice, in quanto utilizza direttamente etichettato Abs primaria 6. Tuttavia, a causa della notevole mancanza di sensibilità, metodi indiretti sono preferiti a quelli diretti. Procedure di rilevamento indiretto due fasi richiedono non marcato Abs primaria, come il primo, ed etichettati Abs secondari diretti contro il Abs primario, come secondo strato 7.amplificazione del segnale può essere ottenuto coinvolgendo ulteriormente, terziaria Ab enzima accoppiato (tre fasi metodo indiretto) che si lega al Ab secondario. metodi di rilevamento indiretto comunemente usati sono avidina-biotina e perossidasi antiperossidasi (PAP). In alternativa, fosfatasi alcalina-antialcalina fosfatasi (APAAP) complesso può essere usato al posto del metodo PAP. In particolare, fosfatasi alcalina (AP) i metodi sembrano essere ancora più sensibile rispetto ai metodi di immunoperossidasi 4. metodo avidina-biotina complesso (ABC) utilizza biotinilato Ab secondario in combinazione con l'etichetta avidina-biotina complesso (LAB), o etichettato streptavidina-biotina complesso (LASTRA). Sensibilità di rilevazione può essere ulteriormente aumentata coinvolgendo avidina marcata con perossidasi o fosfatasi alcalina 8. Altri metodi di rilevamento in uso sono etichettatura polimerico, amplificazione tiramina e immuno-rolling cerchio 9. In particolare, diversi metodi di rilevamento possono essere combinati per la rilevazione multipla Ag nella stessa tessuticampione, che è stato segnalato per la prima volta nel 1978 4. simultanea doppia immunostaining qui presentata è stata eseguita in fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto del sistema nervoso centrale e LN sezioni di tessuto con perossidasi-bound e AP-coniugati anticorpi secondari, rispettivamente. I segnali sono stati visualizzati con 3,3'-diaminobencidine (DAB) cromogeno e il Fast Blue (FB) APAAP complesso, rispettivamente.

Protocol

Dichiarazione etica presente studio è effettuata in conformità con le linee guida del Consiglio nazionale svedese per gli animali da laboratorio e la direttiva della Comunità europea (86/609 / CEE) sotto i permessi etici N338 / 09, N15 / 10 e N65 / 10, che sono stati approvati dal Comitato del Nord Stoccolma Animal Ethics. 1. Preparazione del tessuto Perfusion & fissazione Anestetizzare l'animale con isoflurano per esegu…

Representative Results

immunostainings doppie (co-colorazioni) sono stati eseguiti in fissati in formalina, inclusi in paraffina ratto sezioni del sistema nervoso centrale e LN. 3-5 micron di spessore fette di tessuto sono stati tagliati con un microtomo slitta, montato successivamente su vetrini adesivo pre-verniciato e trattato come descritto in precedenza 10,11,12. Brevemente, dopo deparaffinizing, reidratazione tessuti e endogena inattivazione perossidasi, sezioni sono stati sottoposti al proces…

Discussion

procedure IHC standard spesso richiedono adattamenti specifici per ottenere un risultato ottimale, che implica comunemente una grande esperienza, ma anche l'approccio "trial and error". Dalla preparazione del tessuto fino visualizzazione di destinazione, quasi ogni fase del protocollo può essere soggetto a modifiche progettate in modo da migliorare il risultato finale. protocollo di doppia colorazione qui presentata esemplifica proteina IHC targeting basato particolarmente adeguato per valutare le interre…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.

This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

Materials

Reagent
Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) Baxter 1001936060 Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment.
Sodiumchloride (NaCl) Merck 1.0604
Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet Sigma-Aldrich P4417
Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS Apl pharma 34 24 28 Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity.
Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) Sigma-Aldrich 459844-1L Flamable.
Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 Sigma-Aldrich 534056 Flamable. Acute toxicity.
Histo-Comp Paraffin Wax Tissue-Tek V0-5-1001
Adhesive Microscope Slides Starfrost MIC-1040-W
Xylol substitute XEM-200 Vogel GmbH ND-HS-200 Respiratory sensitization. Carcinogenicity.
α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA48G
α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody Millipore MABN92
α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody AbD Serotec MCA341R
α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody Santa Cruz BT SC-6181
Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody Dakopatts, Denmark D0314
Biotinylated secondary antibody Amersham Biotech RPN1025
Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) Sigma-Aldrich A3151
Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) Sigma-Aldrich N4875-1G Acute toxicity.
Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) Sigma-Aldrich FBS25
Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) Sigma-Aldrich 31742 Acute toxicity.
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) DAKO S3000 Highly flammable. Toxic.
Copper sulphate (CuSO4) Merck 1.02791 Acute toxicity. Environmental hazzard.
GelTol Aqueous Mounting Medium Thermo Electron Corporation 230100
Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) Merck 107210 Acute toxicity.
Methanol (CH3OH) Fluka 65543 Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable.
Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) AppliChem A1379 Skin and eye irritation.
Tris Buffered Saline (TBS), tablet Sigma-Aldrich T5030
Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) Merck 1.0658
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) Merck 1.06346
Fetal calf serum (FCS) Cambrex BioScience DE-14-802F
DAKO cytomation wash buffer 10x DAKO S3006 Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming.
N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) Fluka 40250 Flammable. Acute toxicity.
Glas coverslips 24 x 36 mm Menzel-Gläser BB024036A1
Hydrochloric acid, conc. (HCl) Sigma-Aldrich 30721 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) Fluka 71826 Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic.
Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) Sigma-Aldrich S2252 Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment.
Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) Merck 1.08454 Oral exposures may cause reproductive and developmental effects.
Equipment
Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor Sakura 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz
Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome Hacker instruments
Household food steamer Braun MultiGourmet FS 20
Light microscope Leica Polyvar 2

Referências

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Citar este artigo
Adzemovic, M. Z., Zeitelhofer, M., Leisser, M., Köck, U., Kury, A., Olsson, T. Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections. J. Vis. Exp. (117), e50425, doi:10.3791/50425 (2016).

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