Sıçan Santral Sinir Sistemi immunohistokimyasal Analizi ve Çevresel lenf nodu Doku Bölümler
Summary
We here present an optimized, detailed protocol for double immunostaining in formalin-fixed, paraffin-embedded rat central nervous system (CNS) and peripheral lymph node (LN) tissue sections.
Abstract
İmmünohistokimya (İHK) son derece özgün, güvenilir ve çekici protein görselleştirme sağlar. Bir IHC tabanlı renkli etiketleme doğru performans ve yorumlama gibi merkezi sinir sistemi (MSS) gibi yüksek yağ içeriğine sahip dokusunda hedef proteinler arasındaki ilişkileri değerlendirmek için kullanılan, özellikle zordur.
Bizim protokol, özellikle fare sinir sistemi ve nöro etkilenen periferal lenf düğümleri (LN), hem de yapısal ve çözünebilir proteinlerin tespiti için düzeltilmiş standart immün tekniğinin bir arıtma temsil eder. Bununla birlikte, daha fazla değişiklik olan veya olmayan, protokol olasılıkla da burada sunulan başka organ ve türlerde, diğer ilgili protein hedeflerinin tespiti için kullanılabilir.
Introduction
methylome, transcriptome hatta proteom düzeyde yapılan analizler gelişmiş yüksek verimlilik kullanımı rağmen, immün doku numunesi, hücre kültürü doğrudan protein tespiti veya bir hücre smear için altın standart olmaya devam etmektedir. yerelleştirme / dağıtım modelini ortaya çıkararak, immünhistokimya (İHK) göreli oranları ve hedef proteinlerin topografik ilişkileri değerlendirmek, ve hatta onların biyolojik aktiviteleri gösterebilir. Bu nedenle, IHC yaygın klinik ve araştırma tanı amacıyla, örneğin, tedavi değerlendirmeleri, hastalık mekanizmaları, hayvan modellerinde fonksiyonel ve fenotipik değişiklikler, vb çalışma için kullanılır
Esasen histoloji, patoloji, biyokimya ve immünoloji oluşan İHK anlamlı floresan etiketli antikorlar enfekte dokuda 1 Pnömokok antijenleri tespit etmek ilk kez kullanıldı 1941 yılından bu yana ilerlemiştir. Vselüler ürünlere ve IHC bileşenlerin isualization spesifik antijen (Ag) antikorlar (ABS) bağlanması üzerine dayanır. Fluorofor etiketli antikorlar kullanılarak Bunun yanı sıra, bağışıklık tepkisi de peroksidaz 2,3 ya da alkalin fosfataz 4 gibi enzimler kullanılarak görüntülenebilir. Radyoaktif etiketler otoradyografi ile görselleştirilmektedir ve daha ileri koloidal altın-etiketli antikorlar 5, ışık ve elektron mikroskopi hem spesifik bir antijen-antikor etkileşimi saptamak için kullanılır.
Ag-Ab immünreaksiyon doğrudan ve dolaylı yöntemlerle tespit edilebilir. Direkt yöntem doğrudan birincil Abs 6 etiketli kullanır gibi esasen daha hızlı ve basittir. Bununla birlikte, duyarlılık önemli olmadığı için, direkt ve indirekt yöntemler olanlar tercih edilir. İki aşamalı indirekt algılama prosedürleri, ikinci kat 7 olarak, birincil Abs yönelik ikincil Abs ilk olarak, birincil Abs etiketsiz ve etiketli gerektirir.Sinyal büyütme daha dahil ederek elde edilebilir, enzime bağlanmış üçüncül antikor (üç aşamalı bir dolaylı yöntem) orta Ab bağlar. Yaygın olarak kullanılan dolaylı saptama yöntemleri avidin-biotin ve peroksidaz antiperoxidase (PAP) bulunmaktadır. Seçenek olarak ise, alkalin fosfataz antialkaline fosfataz (APAAP) kompleksi yerine PAP yöntemi kullanılabilir. Özellikle, alkalik fosfataz (AP) yöntemleri immunperoksidaz yöntemle 4 daha fazla hassas gibi görünmektedir. Avidin-biyotin kompleksi (ABC) yöntemi işaretlenen avidin-biyotin kompleksi (LAB) ile kombinasyon halinde biyotinlenmiş sekonder Ab kullanan, ya da streptavidin-biyotin kompleksi (levha) etiketli. Algılama duyarlılık da peroksidaz veya alkalin fosfataz 8 ile etiketlenmiş avidin dahil ederek arttırılabilir. Kullanılan diğer saptama yöntemleri polimerik etiketleme, tiramin büyütmesi ve bağışıklık haddeleme daire 9 vardır. Özellikle, farklı tespit yöntemleri, aynı dokuda çok Ag tespiti için birleştirilebilirBurada yer alan 1978 4. eşzamanlı yapılan olarak çift immün ilk kez bildirilmiştir örneği sırasıyla peroksidaz-bağlı AP-konjuge sekonder antikor ile formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş sıçan CNS LN doku kesitlerinde uygulandı. sinyalleri sırasıyla, (FB) APAAP kompleksi 3,3'-diaminobencidine (DAB) kromojen ve Fast Blue kullanılarak görselleştirilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Standart İHK prosedürleri genellikle yaygın geniş deneyime değil, aynı zamanda "deneme yanılma" yaklaşımı ima optimal bir sonuç elde etmek özel ayarlamalar gerektirir. Doku hazırlık hedef görselleştirme kadar protokolde neredeyse her adımı tek tek nihai sonucu iyileştirmek için değişiklik tasarlanmış tabi tutulabilir. Burada sunulan Çift boyama protokolü, özellikle nöro etkilenen formalin ile fikse, parafine gömülü sıçan MSS ve LN doku kesitlerinde bizim ilgi hedef proteinleri …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Hans Lassmann and Jan Bauer for their guidance and support. We also thank Katalin Benedek for excellent technical assistance and Caroline Westerlund for critical and linguistic appraisal.
This study was supported by grants from Biogen Idec, the Wenner-Gren Foundation, the Swedish Research Council, the Swedish Association of Persons with Neurological Disabilities, Swedish Brain Foundation, the EU 6TH Framework EURATools (LSHG-CT-2005-019015) and Neuropromise (LSHM-CT-2005-018637). The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane (Isofluran): 1-Chlor-2,2,2-trifluorethyl (difluormethyl ether) 2-Chlor-2-(difluormethoxy)-1,1,1-trifluorethan (C3H2ClF5O) | Baxter | 1001936060 | Eye irradiation. Probably influences fertility and damages baby in uterus. Administer only in adequately equipped anesthetizing environment. |
| Sodiumchloride (NaCl) | Merck | 1.0604 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS), tablet | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| Paraformaldehyde (OH(CH2O)nH (n = 8 – 100), 4% in 1x PBS | Apl pharma | 34 24 28 | Health hazard. Corrosive. Flamable. Acute toxicity. |
| Ethanol ≥99.5%, absolute (CH3CH2OH) | Sigma-Aldrich | 459844-1L | Flamable. |
| Xylene (Xylenes, histological grade; C6H4(CH3)2 | Sigma-Aldrich | 534056 | Flamable. Acute toxicity. |
| Histo-Comp Paraffin Wax | Tissue-Tek | V0-5-1001 | |
| Adhesive Microscope Slides | Starfrost | MIC-1040-W | |
| Xylol substitute XEM-200 | Vogel GmbH | ND-HS-200 | Respiratory sensitization. Carcinogenicity. |
| α- CD8 (Ox-8) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA48G | |
| α- Iba1 (AIF1) mouse anti-rat, primary antibody | Millipore | MABN92 | |
| α- CD68 (ED1) mouse anti-rat, primary antibody | AbD Serotec | MCA341R | |
| α- eotaxin C-19 (CCL11) goat anti-rat, primary antibody | Santa Cruz BT | SC-6181 | |
| Alkaline phosphatase (AP)-conjugated secondary antibody | Dakopatts, Denmark | D0314 | |
| Biotinylated secondary antibody | Amersham Biotech | RPN1025 | |
| Avidin- horseradish peroxidase complex (HRP) | Sigma-Aldrich | A3151 | |
| Naphthol AS-MX phosphate (C19H18NO5P) | Sigma-Aldrich | N4875-1G | Acute toxicity. |
| Fast Blue RR Salt, Azoic Diazo No. 24 (C15H14ClN3O3 x 1/2 ZnCl2) | Sigma-Aldrich | FBS25 | |
| Levamisol hydrochloride (C11H13ClN2S) | Sigma-Aldrich | 31742 | Acute toxicity. |
| 3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride (DAB Chromogen) | DAKO | S3000 | Highly flammable. Toxic. |
| Copper sulphate (CuSO4) | Merck | 1.02791 | Acute toxicity. Environmental hazzard. |
| GelTol Aqueous Mounting Medium | Thermo Electron Corporation | 230100 | |
| Hydrogen peroxide, 30% (H2O2) | Merck | 107210 | Acute toxicity. |
| Methanol (CH3OH) | Fluka | 65543 | Acute toxicity. Respiratory sensitization. Carcinogenicity. Flammable. |
| Tris (hydroxymethyl) aminomethane, TRIS base (C4H11NO3 ) | AppliChem | A1379 | Skin and eye irritation. |
| Tris Buffered Saline (TBS), tablet | Sigma-Aldrich | T5030 | |
| Di- Sodium hydrogen phosphate dihydrate (Na2HPO4 x 2H2O) | Merck | 1.0658 | |
| Sodium dihydrogen phosphate monohydrate (NaH2PO4 x 1H2O) | Merck | 1.06346 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Cambrex BioScience | DE-14-802F | |
| DAKO cytomation wash buffer 10x | DAKO | S3006 | Should be stored at 2-8 °C to inhibit bacterial growth. Avoid foaming. |
| N,N- Dimethylformamide; DMF (C3H7NO) | Fluka | 40250 | Flammable. Acute toxicity. |
| Glas coverslips 24 x 36 mm | Menzel-Gläser | BB024036A1 | |
| Hydrochloric acid, conc. (HCl) | Sigma-Aldrich | 30721 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Hydrochloric acid solution volumetric, 2M HCl (2N) | Fluka | 71826 | Corrosive, irritant, permeator. Lung sensitizer (as acid mist). Toxic. |
| Sodium nitrite, ReagentPlus, ≥99.0% (NaNO2) | Sigma-Aldrich | S2252 | Oxidant. Toxic. Dangerous for the environment. |
| Ethylenedinitrilotetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA; C10H14N2Na2O8 x 2H2O) | Merck | 1.08454 | Oral exposures may cause reproductive and developmental effects. |
| Equipment | |||
| Tissue-Tek V.I.P Vacuum Infiltration Processor | Sakura | 5902 VIP Jr. 115 V, 60 Hz | |
| Hacker-Bright 8000 Series Base Sledge Microtome | Hacker instruments | ||
| Household food steamer | Braun | MultiGourmet FS 20 | |
| Light microscope | Leica Polyvar 2 |
Referências
- Coons, A., Creech, H. J., Jones, R. N. Immunological properties of an antibody containing a fluorescent group. Proc Soc Exp Biol Med. 47, 200-202 (1941).
- Nakane, P. K., Pierce, G. B. Enzyme-labeled antibodies: preparation and application for the localization of antigens. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 14, 929-931 (1966).
- Avrameas, S., Uriel, J. Method of antigen and antibody labelling with enzymes and its immunodiffusion application. C R Acad Sci Hebd Seances Acad Sci D. 262, 2543-2545 (1966).
- Mason, D. Y., Sammons, R. Rapid preparation of peroxidase: anti-peroxidase complexes for immunocytochemical use. Journal of immunological. 20, 317-324 (1978).
- Faulk, W. P., Taylor, G. M. An immunocolloid method for the electron microscope. Immunochemistry. 8, 1081-1083 (1971).
- Coons, A. H., Kaplan, M. H. Localization of antigen in tissue cells; improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent antibody. The Journal of experimental medicine. 91, 1-13 (1950).
- Polak, J. M., Van Noorden, S. . Introduction to immunocytochemistry. , (2003).
- Elias, J. M., Margiotta, M., Gaborc, D. Sensitivity and detection efficiency of the peroxidase antiperoxidase (PAP), avidin-biotin peroxidase complex (ABC), and peroxidase-labeled avidin-biotin (LAB) methods. American journal of clinical pathology. 92, 62-67 (1989).
- Ramos-Vara, J. A. Technical aspects of immunohistochemistry. Vet Pathol. 42, 405-426 (2005).
- Adzemovic, M. Z., et al. Expression of Ccl11 associates with immune response modulation and protection against neuroinflammation in rats. PloS one. 7, 39794 (2012).
- Bauer, J., et al. Endoplasmic reticulum stress in PLP-overexpressing transgenic rats: gray matter oligodendrocytes are more vulnerable than white matter oligodendrocytes. Journal of neuropathology and experimental neurology. 61, 12-22 (2002).
- Bradl, M., Bauer, J., Flugel, A., Wekerle, H., Lassmann, H. Complementary contribution of CD4 and CD8 T lymphocytes to T-cell infiltration of the intact and the degenerative spinal cord. The American journal of pathology. 166, 1441-1450 (2005).
- Zhang, C., Lam, T. T., Tso, M. O. Heterogeneous populations of microglia/macrophages in the retina and their activation after retinal ischemia and reperfusion injury. Experimental eye research. 81, 700-709 (2005).
- Hirasawa, T., et al. Visualization of microglia in living tissues using Iba1-EGFP transgenic mice. Journal of neuroscience research. 81, 357-362 (2005).
- Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., Littman, D. R. Cell-cell adhesion mediated by CD8 and MHC class I molecules. Nature. 336, 79-81 (1988).
- Hoetelmans, R. W., van Slooten, H. J., Keijzer, R., Jvan de Velde, C. J., van Dierendonck, J. H. Routine formaldehyde fixation irreversibly reduces immunoreactivity of Bcl-2 in the nuclear compartment of breast cancer cells, but not in the cytoplasm. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 74-80 (2001).
- Hayat, M. . Microscopy, Immunohistochemistry and antigen retrieval methods for light and electron microscopy. , (2002).
- Boenisch, T. Formalin-fixed and heat-retrieved tissue antigens: a comparison of their immunoreactivity in experimental antibody diluents. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 9, 176-179 (2001).
- Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 39, 741-748 (1991).
- Huang, S. N. Immunohistochemical demonstration of hepatitis B core and surface antigens in paraffin sections. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 33, 88-95 (1975).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 45, 327-343 (1997).
- Taylor, C. R., Shi, S. R. Antigen retrieval: call for a return to first principles. Applied immunohistochemistry & molecular morphology : AIMM / official publication of the Society for Applied Immunohistochemistry. 8, 173-174 (2000).
- Kitamoto, T., Ogomori, K., Tateishi, J., Prusiner, S. B. Formic acid pretreatment enhances immunostaining of cerebral and systemic amyloids. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 57, 230-236 (1987).
- Nelson, P. N., et al. Monoclonal antibodies. Molecular pathology : MP. 53, 111-117 (2000).
- Van der Loos, C. . Immunoenzyme multiple staining methods. , (1999).
- Elias, J. . Immunohistopathology. A practical approach to diagnosis. , (2003).
- Straus, W. Letter: Cleavage of heme from horseradish peroxidase by methanol with inhibition of enzymic activity. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 22, 908-911 (1974).
- Streefkerk, J. G. Inhibition of erythrocyte pseudoperoxidase activity by treatment with hydrogen peroxide following methanol. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 20, 829-831 (1972).
- Ponder, B. A., Wilkinson, M. M. Inhibition of endogenous tissue alkaline phosphatase with the use of alkaline phosphatase conjugates in immunohistochemistry. The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 29, 981-984 (1981).
- Petrelli, F., Coderoni, S., Moretti, P., Paparelli, M. Effect of biotin on phosphorylation, acetylation, methylation of rat liver histones. Molecular biology reports. 4, 87-92 (1978).
- Yagi, T., Terada, N., Baba, T., Ohno, S. Localization of endogenous biotin-containing proteins in mouse Bergmann glial cells. The Histochemical journal. 34, 567-572 (2002).
- Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
