Vi beskriver en roman<em> In vivo</em> Bildteknik att par fluorescerande chimära möss med intrakraniella fönster och högupplösta 2-foton mikroskopi. Denna avbildning plattform hjälpmedel studier av dynamiska förändringar i hjärnvävnaden och mikrovaskulaturen, vid en enda cell nivå efter patologiska förolämpningar och är anpassningsbar för att bedöma intrakraniell drug delivery och distribution.
Vi har framgångsrikt integrerat tidigare fastställts Intracranial fönster (ICW) teknologi 1-4 med intravital 2-fotonen konfokalmikroskopi att utveckla en ny plattform som möjliggör direkta långsiktiga visualisering av förändringar vävnadsstruktur intrakranialt. Imaging vid en enda cell upplösning i realtid mode ger kompletterande dynamisk information utöver den som lämnas av standard slutpunkt histologisk analys, som ser enbart på "snap-shot" tvärsnitt av vävnad.
Etablera denna intravital bildteknik i fluorescerande chimära möss, kan vi avbilda fyra fluorescerande kanaler samtidigt. Genom att införliva fluorescensmärkta celler, såsom GFP + benmärg, är det möjligt att spåra ödet för dessa celler att studera deras långsiktiga migration, integration och differentiering inom vävnaden. Ytterligare integrering av en sekundär reporter cell, såsom en mCherry gliom tumörlinjen, möjliggör karakteterization av cell: cell interaktioner. Strukturella förändringar i vävnaden microenvironmenten kan belysas genom tillsats av intra-vitala färgämnen och antikroppar, t.ex. CD31 märkta antikroppar och dextranmolekyler.
Dessutom beskriver vi en kombination av vår ICW imaging modell med ett litet djur mikro-irradiator som ger stereotaktisk bestrålning, skapa en plattform, där de dynamiska vävnad förändringar som sker efter administrering av joniserande strålning kan bedömas.
Aktuella begränsningar av vår modell är penetrans av mikroskop, som är begränsad till ett djup av upp till 900 nm från sub kortikala ytan, begränsar avbildning till rygg axel hjärnan. Närvaron av skallbenet gör ICW en mer utmanande tekniskt förfarande, jämfört med de mer etablerade och utnyttjas kammare modeller har använts för att studera bröstvävnad och fettkuddarna 5-7. Dessutom ICW PROVIdeS många utmaningar när optimera avbildning.
En bättre förståelse av de strukturella och biologiska förändringar som uppstår i hjärnan som svar på olika patologier, och terapeutiska insatser är avgörande för att förbättra behandlingsstrategier. Men en av de aktuella utmaningarna i att studera dessa strukturella och biologiska förändringar, särskilt när det gäller intrakraniella sjukdomar, är otillgänglighet av vävnaden och oförmågan att studera tidsutvecklingen och dynamisk utveckling av ändringar i en in vivo-miljö. Den generation av "fönster"-tekniken har tidigare visat sig vara framgångsrik i att undersöka mjukdelar förändringar genom tumörutveckling 5-7. Utveckling av ICW modeller visar sig vara mer tekniskt utmanande, på grund av nödvändigheten att avlägsna skallbenet utan att skada på anstiftan infektion i den underliggande cerebrala vävnaden. Tidigare artiklar har försökt att förtunna skallen att visualisera vävnad 8-10 dock att producera hög upplösning klar imåldrar blir fullt avlägsnande av skallbenet krävs 11. Upprepa långsiktig imaging (30 dagar +) har först nyligen blivit ett genomförbart alternativ genom avbildning 1,11, har tidigare kortare tidsramar studerats 5.
Under det senaste decenniet ett viktigt mål har varit att belysa ursprunget till neo-vaskulaturen följande patologiska stimuli, särskilt som svar på tumörbildning och progression, att tillhandahålla nya terapeutiska mål för behandling av tumörer. Mycket kontrovers kvarstår kring källan till nya kärlen i hjärnan under tumörutveckling eller efter strålning. Traditionellt vaskularisation har ansett att ske genom angiogenes, en process genom vilken nya fartyg bildas från groning av befintliga fartyg 12. Nyare studier tyder dock på att det tidigare antagits embryonala process av vaskulogenes kan spela en mer betydande roll i bildandet av patologiska kärlsystem. Vasculogenesis innebär rekryteringen av de vuxna angioblast motsvarigheter från benmärgen som i sin tur sedan direkt involverade i bildandet av nya fartyg endotel 12-14. Ackumulerande bevis tyder på att endothelial precursorceller mobiliseras från benmärgen att inleda de novo kärlbildning svar på onkogena medlare 15-17. Men dessa studier ger motstridiga bevis för direkta bidrag av dessa ben härledda benmärgsceller (BMDCs) till fartyget endotel med procentuella bidrag varierar med typ av patologiska stimulus och respons på behandlingen 18-21.
Därför, om inrättande reproducerbara experimentella metoder som möjliggör hög upplösning intravital avbildning för upprepad långsiktig studie av processen BMDC integration i tumörvaskulatur och som svar på terapi är ovärderlig. Standard histologiska tekniker misslyckas med att tillhandahålla den dynamiska infortion som krävs för att bestämma långsiktig överlevnad, differentiering och integrering av cellerna som ger upphov till neovaskulatur och kan därför inte uppvisa slutgiltigt mekanismerna för cellinteraktion.
Vi har visat att använda vår experimentella tillvägagångssätt att det finns en varierande grad av BMDC rekrytering efter både intrakraniell joniserande strålning och tumörtillväxt, en rekrytering som är emellertid patologi platsspecifik och inte en invasion av hela intrakraniell vävnaden 11,22. Vi har visat att rekryteringen följer en tid känslig mönster framgår av upprepad avbildning av ett enda djur 11,22. Likaså kan in vivo imaging också ge ovärderliga insikter i tumörceller härmning där fluorescerande taggade tumörceller kan avbildas och spåras med en intra-vital CD31 antikropp för endotelceller att belysa möjligheten av tumörceller transdifferentiering att direkt bilda sin egen endotel.
<pclass = "jove_content"> Mångsidigheten av modellen förstärks av förmågan att bilden fyra fluorescerande kanaler, vilket ger en uttömmande antal kombinationer för studier av varierande cell-och biologisk process. Vi har möjlighet att intravitally bild CFP (blå), GFP (grönt), Cherry / RFP (röd), och Alexa647/APC (mån-röd), samtidigt i ett enda fält flera gånger under tiden. Forskare kan genetiskt modifiera celler att uttrycka fluorokromer för varje kanal samt färgämnen köp och antikroppar för att belysa strukturella förändringar av särskilt intresse. Hittills färgämnen och antikroppar som vanligen används i studier inkluderar CD31 och dextran som belyser båda mikrovaskulaturen och dess förändringar i vävnaden 1,11,23,24, även om vi utnyttjade det bortre röda kanalen för detta ändamål båda är tillgängliga för användning i den andra kanaler som nämns. Likaså har andra färgämnen inklusive Sytox Orange, som kommer att belysa områden av apoptos, och markörer såsom de från företaget Visen, varit specifically utformade för användning in vivo. Utöver de fyra vanligaste fluorescerande nämnda kanaler, kan en andra harmonic generation (SHG) kanal tillsättas och optimeras för att avbilda de endogena kollagenfibrer av modellen 7, visualisera basalmembranet omgivande kärlsystem.För att visa anpassningsförmåga vår modell, samt cell-cell interaktioner som nämns ovan, har vi kunnat studera drog-cell-interaktioner. Vi har tittat på narkotika hämmare som AMD3100, en SDF-1-hämmare, och dess roll för att signalera nätverk som deltar i BMDC rekrytering 11. Likaså har vi genetiskt engineered ut U87 gliom xenografter celler att uttrycka VEGFTrap, en VEGF-hämmare 25, i förening med en IRES till en GFP molekyl. Genom att använda RFP + BM har vi möjlighet att studera vilken roll VEGF har på rekryteringen av BMDCs till kärlsystemet. Nu senast har vi utnyttjat den modell för att studera drogen kinetik tittar på MEChanism bakom tumör-skissera drog fluorescein 26, på cellnivå. Genom att använda en specialbyggd i huset litet djur irradiator vi kunnat integrera stereotaktisk levererad strålning att bedöma svaret av både tumör och BMDCs till behandling.
Genom att använda våra nya intravital forskare avbildningsmetod kommer att få insikt i de encelliga realtid förändringar som sker i olika patologier och system, medhjälp klarlägga många funktionella och biologiska egenskaper vävnad förändringar.
De tre kanaler som beskrivs i alla bilderna hittills är utbytbara för tre markörer av intresse i andra modeller och blad forskare med en ovärderlig uppsättning verktyg för att söka ett flertal celltyper och interaktioner. Planering krävs för att säkerställa att alla markörer och celltyper framgångsrikt har integrerat en molekyl reporter fluorescens i en tydlig kanal.
Förutom de vanliga tre kanaler som används här kunde vi också integrera en fjärde GFP-kanal (figur 4A) och en SHG baserad kollagen kanal 7 (Figur 4B). Detta förlänger möjligheten att titta på cellulära interaktioner in vivo och dessutom tillåter användaren att göra befolkningen blandning för att studera specifika cell-cell interaktioner samtidigt behålla två kanaler för andra markörer. Till exempel har vi tittat på tumörceller (RFP) och cancer stamceller (GFP) i ett förhållande av 01:03 med ett intresse att jämföra deras intratummuntliga interaktioner (Figur 4A). Vi konstaterade att 7 dagar efter implantation av den blandade befolkningen förhållandet bifölls och båda cellpopulationerna kan fortfarande ses.
Den gemensamma fiskeripolitiken kanal ger tekniska problem på grund av överlappningen med GFP-kanalen i både excitation och emission spektra och som sådan kräver inlägget bildbehandling för att definiera den sanna GFP + celler från dem som faktiskt GFP +. Post bildbehandling kan utföras på 2-photon mikroskop byggda i Zeiss LSM programvara direkt där, är GFP bilden subtraheras från den gemensamma fiskeripolitiken bilden resulterar i sann GFP cellerna kvar (Figur 4A). Utgångspunkten för förhållandet subtraktion är beroende av lika ljusa bilder och beror på att den gemensamma fiskeripolitiken laser (458 nm) fluorescerar både GFP och celler GFP medan GFP laser (488 nm) är för hög för att fluorescerar den gemensamma fiskeripolitikens cellerna. Förutom att den gemensamma fiskeripolitiken har vi också kunnat använda tidigare publicerade inställningar för att titta på SHGnivåer och så skildra de kollagenfibrer som utgör basalmembranet omger vaskulatur, (figur 4B).
En annan anpassning av denna modell har utnyttjat en specialbyggd litet djur irradiator som har förmågan att använda stereotaktisk strål att bestråla delar av vävnaden så små som 2 mm i diameter. Genom att rikta fönstret med bestrålning är det möjligt att titta på effekten strålningen har på den underliggande vävnaden. Vi har nyligen publicerat en studie som undersöker effekten strålningen har på normal hjärnvävnad med avseende på rekryteringen av BMDCs till kärlsystemet, tittar specifikt på sin roll efter förändringar strålning vävnad. Vi fann att rekryteringen av BMDCs var både tid och dosberoende i normal vävnad 11.
Det är möjligt att studera mekanismerna för leverans och integration av terapeutika som tillhandahåller läkemedlet är märkt med en fluorescerande markör. Undervår forskning har vi kunnat spåra produktionen av VEGFTrap, en anti-angiogen läkemedel som blockerar alla VEGF-signalering i det lokala området för produktion 25. Genom att genetiskt modifiera våra tumörceller att uttrycka VEGFtrap genen tillsammans med en IRES till EGFP (Figur 4Ci) och använder RFP "givare" BM vi kunde avbilda EGFP: VEGFtrap produktion, BMDC interaktion och kärlsystem samtidigt (Figur 4Cii). Detta visade mångsidighet av modellen och kanaler tillgängliga. Det är också tänkbart att titta på kinetiken hos läkemedlet på grund av löftet om encelliga upplösning. Fluorescein (GFP +) används för att avgränsa tumörer under kirurgi för att säkerställa maximal resektion uppnås 26. Genom att injicera intravenöst medan avbildning är det möjligt att visa att avgränsningen sker inte genom aktivt upptag av fluorescein i tumörcellerna själva, utan istället genom insamling av läkemedlet i stromal området med time, sett av bristen på co-lokalisering 10 min efter injektion av den Fluorescein (Figur 4D).
Övergripande vår strategi kombinerar nya och befintliga tekniker för att uppnå en unik experimentell plattform, vilket är fördelaktigt i studiet av dynamiska cellulära interaktioner. Denna strategi har visat sig vara en ovärderlig metod för att pröva högupplösta encelliga dynamisk utveckling BMDC, tumör och normal hjärna vaskularitet svar på terapi, intrakranialt. Intravital bildbehandling kan ge en bättre förståelse för de molekylära regulatorer av BMDC rekrytering, migration och differentiering i intrakraniell hjärntumör kärlsystemet liksom många andra dynamiska processer anpassas till andra forskningsområden. Hämmande förmodade faktorer som reglerar BMDC i kombination med andra terapeutiska strategier kan underlätta identifieringen av den exakta tidpunkten för kombinatoriska terapier. Dessutom kan denna strategi anpassas till många framtida projects utnyttjar inte bara in vivo intravital färgning färgämnen, men också små molekylära inhibitorer och nanopartiklar som fluorescerande är taggade låta forskare spåra distributionen och migrationsmönster av mer riktade terapier samt titta längdriktningen på deras kinetik.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Advanced optisk mikroskopi Facility vid Princess Margaret Hospital, i synnerhet James Jonkman för deras hjälp i den inledande installationen av kanaler på 2Photon mikroskop. Författarna vill tacka för den tid och rum Targeting och förstärkning av strålning svar (STTARR) programmet och dess närstående finansiärer. Vi tackar Dr Peter Tonge, Dr.Iacovos Michael och Dr.Andras Nagy för att försörja de VEGFTrap plasmider och för sina handskrivna korrigeringar och feedbacken. Den fortsatta stöd och diskussion från personalen på BTRC har varit ovärderlig och vi vill Commemorate Dr.Abhijit Guha för hans vetenskapliga bidrag. Arbetet har finansierats av CIHR och NIH bidrag.
Reagent | |||
NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
Vetbond | 3M | 1469SB | |
Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
Equipment | |||
Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
22G Needle | BD | 305156 | |
27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |