רומן ברזולוציה גבוהה<em> בvivo</em> טכניקת הדמיה כדי לחקור את התגובה דינמית של מבנים תוך גולגולתי לצמיחה גידול וTherapeutics
Summary
אנו מתארים רומן<em> In vivo</em> טכניקת הדמיה שזוגות עכברי chimeric ניאון עם חלונות תוך גולגולתי ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה 2 פוטונים. מחקרי הדמיה זו פלטפורמת איידס של שינויים דינמיים ברקמת המוח וmicrovasculature, ברמת תא בודד, בעקבות עלבונות פתולוגיים וניתנים להתאמה על מנת להעריך משלוח סמים תוך גולגולתי והפצה.
Abstract
יש לנו בהצלחה המשולב הוקם בעבר חלון (ICW) טכנולוגיה תוך גולגולתי 1-4 עם intravital מיקרוסקופיה confocal 2 פוטונים לפיתוח פלטפורמה חדשנית המאפשרת להדמיה לטווח ארוך ישירה של שינויים במבנה רקמות intracranially. הדמיה ברזולוציה תא בודד באופנה בזמן אמת מספקת מידע דינמי משלים מעבר לזה הניתן על ידי ניתוח היסטולוגית נקודת סיום סטנדרטי, שנראה אך ורק בחתכים "Snap-shot" של רקמת גוף.
הקמת טכניקת ההדמיה intravital זה בעכברי chimeric ניאון, אנו מסוגלים לתמונת ארבעה ערוצים בו זמנית ניאון. על ידי תאים שכותרתו fluorescently המשלבים, כגון ה-GFP + מח עצם, ניתן לעקוב אחר גורלם של תאים אלה הלומדים לטווח ארוך ההגירה, האינטגרציה והבידול שלהם בתוך רקמה. שילוב נוסף של תא עיתונאי המשני, כגון קו גידול glioma mCherry, מאפשר למאפייניםterization של תא: אינטראקציות תא. יכולים להיות מודגשים שינויים מבניים בmicroenvironment הרקמות באמצעות התוספת של צבעים ונוגדני התוך חיוניים, למשל CD31 נוגדנים מתויגים ומולקולות dextran.
יתר על כן, אנו מתארים את השילוב של מודל ההדמיה ICW שלנו עם בעלי החיים מייקר irradiator קטן המספק הקרנת stereotactic, יצירת פלטפורמה שדרכו ניתן להעריך את השינויים ברקמות הדינמיים המתרחשים בעקבות הממשל של קרינה מייננת.
מגבלות הנוכחיות של המודל שלנו כוללות penetrance של המיקרוסקופ, אשר מוגבלת לעומק של עד 900 מיקרומטר ממשטח קליפת המוח המשנה, להגביל הדמיה לציר הגבי של המוח. נוכחותו של עצם הגולגולת הופכת ICW הליך טכני מאתגר יותר, בהשוואה למודלים המבוססים יותר ומנוצלים קאמריים המשמשים כיום ללמוד רקמת שד ורפידות שומן 5-7. בנוסף, prov ICWאידו אתגרים רבים בעת מיטוב ההדמיה.
Introduction
הבנה טובה יותר של שינויים המבניים וביולוגיים המתעוררים במוח בתגובה לפתולוגיות שונות, והתערבויות טיפוליות היא קריטית לשיפור אסטרטגיות טיפול. עם זאת, אחד האתגרים הנוכחיים בחקר שינויים מבניים וביולוגיים אלה, במיוחד בנוגע לפתולוגיות תוך גולגולתי, הוא הנגישות של הרקמות וחוסר היכולת ללמוד את האבולוציה של הזמן וההתקדמות דינמית של שינויים בהגדרה בvivo. הדור של הטכנולוגיה "החלון" הוכיח בעבר בהצלחה בבחינת שינויים ברקמות רכות באמצעות התפתחות גידול 5-7. פיתוח המודלים ICW מוכיח להיות מאתגרת יותר מבחינה טכנית, בשל ההכרח להסיר את עצם הגולגולת מבלי לפגוע בייזום דלקת ברקמת המוח הבסיסית. מאמרים קודמים ניסו לדלל את הגולגולת כדי להמחיש את 8-10 הרקמות לעומת זאת, כדי לייצר im ברור ברזולוציה הגבוהההסרת מלאה של גילים עצם הגולגולת נדרש 11. חזור לטווח ארוך הדמיה (30 ימים +) רק לאחרונה הפכה לאופציה אפשרית באמצעות הדמיה 1,11, מסגרות זמן קצרות יותר בעבר נחקרו 5.
במהלך העשור האחרון מטרה עיקרית הייתה להבהיר את המקור של הגירויים פתולוגיים הבאים הניאו כלי דם, במיוחד בתגובה להיווצרות והתקדמות גידול, כדי לספק מטרות טיפוליות חדשניות לטיפול בגידולים. מחלוקת הרבה נשארה סביב המקור של כלי דם חדשים במוח במהלך התפתחות גידול או ההקרנות הבאות. באופן מסורתי כלי דם נחשב ללהתרחש באמצעות אנגיוגנזה, תהליך שבו יוצרים כלי דם חדשים מההנבטה של קיימים כלי 12. מחקרים מאוחרים יותר לעומת זאת, מצביעים על כך שהתהליך העוברי הניח בעבר של vasculogenesis ניתן לשחק תפקיד משמעותי יותר בהיווצרות כלי דם פתולוגי. Vasculogenesis כרוך הגיוס של עמיתי angioblast בוגרים ממח העצם אשר בתורו ואז הם מעורבים באופן ישיר ביצירת כלי חדש האנדותל 12-14. צבירת ראיות מצביעה על כך שתאי האנדותל מבשר מגויסים ממח העצם ליזום היווצרות כלי נובו דה בתגובה למתווכים שעור 15-17. עם זאת, מחקרים אלה מספקים ראיות סותרות לתרומה הישירה של תאים במח עצם אלה נגזרים (BMDCs) להאנדותל כלי עם תרומת שיעור משתנה עם הסוג של גירוי ותגובה לטיפול 18-21 פתולוגי.
לכן, הקמת שיטות ניסיוניות לשחזור המאפשרות הדמיה intravital ברזולוציה גבוהה למחקר ארוך טווח חוזר ונשנה של תהליך האינטגרציה BMDC לכלי דם של גידול ובתגובה לטיפול לא תסולא בפז. טכניקות היסטולוגית סטנדרטיות אינן מספקות אינפור הדינמיmation נדרש על מנת לקבוע את ההישרדות לטווח ארוך, גזירה והאינטגרציה של התאים המקנים neovasculature ולכן לא ניתן להוכיח בודאות את המנגנונים של אינטראקציה תא.
הראנו באמצעות הגישה הניסויית שלנו, כי יש מידה שונה של גיוס BMDC בעקבות שניהם קרינה מייננת תוך גולגולתי וגידול, כי גיוס הוא לעומת זאת, אתר הפתולוגיה ספציפי ולא פלישה של הרקמה 11,22 כולו תוך גולגולתי. אנחנו הראינו כי הגיוס כדלקמן דפוס זמן רגיש הודגם על ידי ההדמיה החוזרת ונשנית של חיה אחת 11,22. בדומה לכך, בתחום ההדמיה vivo גם יכול לספק תובנות רבות ערך לחיקוי לפיה תאי גידול יכולים להיות צילמו תאים סרטניים מתויגים fluorescently ומעקב עם CD31 נוגדן התוך חיוני לתאי האנדותל כדי להדגיש את האפשרות של transdifferentiation תאים הסרטני כדי ליצור האנדותל שלה באופן ישיר.
<pclass = "jove_content"> הרבגוניות של המודל מוגברת על ידי יכולת תמונה 4 ערוצי ניאון, מתן מספר ממצה של שילובים לחקר משתנה תהליך תאי וביולוגי. אנו מסוגלים intravitally תמונת CFP (כחול), GFP (ירוק), דובדבן / RFP (אדום), וAlexa647/APC (הרבה אדום), בו זמנית בשדה אחד שוב ושוב לאורך זמן. חוקרים גנטי ניתן לשנות תאים להביע fluorochromes עבור כל אחד מהערוצים, כמו גם רכישה חומרי צבע ונוגדנים כדי להדגיש את השינויים מבניים של עניין מיוחד. עד כה צבעים ונוגדנים נפוצים במחקרים כוללים CD31 וdextran שהן גולת הכותרת microvasculature והשינויים שלה ברקמה 1,11,23,24, למרות שאנו מנוצלים הערוץ מרחיק האדום למטרה זו הן זמינים לשימוש בשני ערוצים שהוזכרו. כמו כן, צבעים אחרים, כולל Sytox אורנג', אשר ידגיש תחומים של אפופטוזיס, וסמנים כגון אלה מVISEN החברה, היו SPEcifically נועד לשימוש בגוף חי. בהמשך לארבעה ערוצי הניאון נפוצים שהוזכרו, דור הרמוני שני ערוץ (SHG) ניתן להוסיף ומותאם לתמונה את סיבי קולגן אנדוגניים של המודל 7, לדמיין את הקרום במרתף סביב כלי דם.כדי להדגים את יכולת ההתאמה של המודל שלנו, כמו גם את תאי תאי אינטראקציות שהוזכרו לעיל, היינו מסוגל ללמוד אינטראקציות סמים סלולריים. יש לנו הסתכלנו מעכבי סמים כמו AMD3100, מעכב SDF-1, ותפקידה באיתות הרשתות מעורבות בגיוס BMDC 11. כמו כן יש לנו הנדסה גנטית מתוך תאי U87 xenografts glioma להביע VEGFTrap, מעכב VEGF 25, בשיתוף באמצעות כ IRES למולקולת ה-GFP. באמצעות RFP + בע"מ אנו מסוגלים ללמוד את התפקיד יש VEGF על גיוס BMDCs לכלי הדם. לאחרונה יש לנו מנוצלים המודל ללמוד קינטיקה סמים מסתכל MEChanism מאחורי תרופת 26 העמסת גידולים המגדיר, ברמה תאית. באמצעות השימוש מותאם אישית שנבנה בirradiator חיה הקטן הבית הצלחנו לשלב קרינה מועברת stereotactic כדי להעריך את התגובה של שניהם וגידול BMDCs לטיפול.
באמצעות השימוש בשיטת ההדמיה חוקרי intravital הרומן שלנו לקבל תובנות לגבי השינויים בזמן אמת התא בודד המתרחשים בפתולוגיות ומערכות שונות, סיוע להבהרה של תכונות פונקציונליות וביולוגיות רבות של שינויים ברקמות.
Protocol
Representative Results
Discussion
השלושה הערוצים המתוארים בכל התמונות עד כה הם מתחלפים לשלושה סמני עניין בדגמים אחרים וחוקרים יוצא עם סט של כלים רב ערך ל, ייראו סוגי תאים רבים ואינטראקציות. תכנון נדרש כדי להבטיח את כל הסמנים וסוגי תאים שילבו מולקולת הקרינה כתב בהצלחה בערוץ נפרד.
בנוסף לשלושת הערוצים הסטנדרטיים המשמשים כאן היינו גם יכולים לשלב את ערוץ CFP רביעי (איור 4 א) וקולגן מבוסס SHG ערוץ 7 (איור 4). זו מרחיבה את האפשרות להסתכל על אינטראקציות הסלולר in vivo, ובנוסף מאפשר לי משתמש מתחייב אוכלוסיית ערבוב ללמוד תאי תאי אינטראקציות ספציפיות תוך שמירה על שני ערוצים לסמנים אחרים. לדוגמה, יש לנו הסתכלנו תאים סרטניים (RFP) ותאי גזע סרטניים (CFP) ביחס של 1:03 בעניין בהשוואת intratumאינטראקציות אוראליות (איור 4 א). הבחנו כי 7 ימים לאחר ההשתלה של האוכלוסייה המעורבת היחס היה אישר ושתי אוכלוסיות התאים עדיין אפשר היו לראות.
ערוץ CFP מספק בעיות טכניות בשל החפיפה עם ערוץ ה-GFP בשניהם ספקטרום עירור ופליטה ובתור שכזו דורשת עיבוד הדמיה הפוסט להגדיר CFP האמיתי + תאים מאלה שהם למעשה ה-GFP +. עיבוד הדמיה הודעה יכול להתבצע על המיקרוסקופים 2 הפוטון שנבנו בתוכנת Zeiss LSM ישירות לפיו, את דמותו של GFP יורד מתמונת CFP וכתוצאה מכך תאי CFP האמיתיים נשאר מאחור (איור 4 א). הנחת היסוד ליחס החיסור תלויה בתמונות לא פחות בהירות ובשל לייזר CFP (458 ננומטר) fluorescing שניהם CFP ותאי GFP תוך לייזר GFP (488 ננומטר) הוא גבוהה מדי לתאים לזרוח CFP. בנוסף לCFP יש לנו גם היו מסוגלים להשתמש במערכים שפורסמו בעבר להסתכל על SHGרמות וכך מתארים את סיבי הקולגן המרכיבים את הקרום במרתף סביב כלי דם, (איור 4).
התאמה נוספת של מודל זה לקחה את היתרון של irradiator חיה מותאם אישית שנבנה קטן שבו יש את היכולת להשתמש בקרינה מודרכת stereotactic כדי להקרין קטעים של רקמה קטנה כמו 2 מ"מ קוטר. על ידי מיקוד החלון עם הקרנה אפשר להסתכל על ההשפעה שיש קרינה על הרקמה הבסיסית. יש לנו לאחרונה פרסמתי מחקר מסתכל על ההשפעה שיש קרינה על רקמת מוח נורמלית ביחס לגיוס של BMDCs לכלי הדם, מחפש במיוחד בתפקידם בשינויי רקמות קרינת פוסט. מצאנו כי הגיוס של BMDCs היה גם זמן ומינון תלוי ברקמה נורמלית 11.
זה אפשרי ללמוד את המכניזם של אספקה ואינטגרציה של תרופות במתן התרופה מתויג עם סמן פלואורסצנטי. במהלךהמחקר שלנו הצלחנו לעקוב אחר ייצור של VEGFTrap, תרופה אנטי angiogenic אשר חוסמת כל איתות VEGF באזור המקומי של ייצור 25. באמצעות שינוי גנטי בתאים הסרטניים שלנו להביע את גן VEGFtrap יחד עם IRES לEGFP (איור 4Ci) ובאמצעות "התורם" RFP BM הצלחנו תמונה EGFP: ייצור VEGFtrap, אינטראקציה וכלי דם בו זמנית (איור 4Cii) BMDC. זה הוכיח את הרבגוניות של המודל וערוצים זמינים. זה גם אפשרי להסתכל על קינטיקה של התרופה בשל ההבטחה של רזולוציה תא בודד. העמסה (GFP +) משמשת כדי לשרטט גידולים במהלך ניתוח על מנת להבטיח כריתה מקסימלי מושגת 26. על ידי הזרקה לוריד תוך הדמיה ניתן להוכיח כי התיחום מתרחש לא דרך הספיגה הפעילה של ההעמסה לתוך התאים הסרטניים עצמם, אלא דרך האוסף של התרופה לאזור סטרומה עם לאIME, נתפס על ידי חוסר שיתוף לוקליזציה 10 דקות לאחר ההזרקה של ההעמסה (איור 4D).
בסך הכל האסטרטגיה שלנו משלבת טכניקות חדשניות וקיימות כדי להשיג פלטפורמה ניסיונית ייחודית, וזה יתרון במחקר של אינטראקציות הסלולר דינמיות. אסטרטגיה זו הוכיחה להיות גישה לא יסולא בפז לבחינת התפתחות דינמית תא בודד ברזולוציה הגבוהה של BMDC, כלי דם במוח וגידול נורמלי בתגובה לטיפול, intracranially. Intravital הדמיה יכולה לספק הבנה טובה יותר של הרגולטורים המולקולריים של BMDC גיוס, הגירה ובידול בכלי דם תוך גולגולתי גידול במוח, כמו גם רבים אחרים תהליכים דינמיים וישימה לתחומי מחקר אחרים. גורמים המשוערת עיכוב המווסתים BMDC בשילוב עם אסטרטגיות טיפוליות אחרות יכולים לסייע בזיהוי העיתוי המדויק של טיפולים קומבינטורית. יתר על כן, אסטרטגיה זו יכולה להיות מותאמת ליחסי ציבור רבים בעתידojects ניצול לא רק בצבעים מכתים intravital vivo, אלא גם מעכבים מולקולריים קטנים וחלקיקים שהם מתויגים fluorescently ומאפשר לחוקרים להתחקות אחר דפוסי נדידה והפצה של תרופות ממוקדות יותר, כמו גם להסתכל longitudinally בקינטיקה שלהם.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות למתקן מיקרוסקופיה האופטי מתקדם בנסיכת מרגרט החולים, בפרט ג'יימס Jonkman על עזרתם בהגדרה הראשונית של ערוצים במיקרוסקופ 2Photon. המחברים מבקשים להודות מיקוד מרחב ובזמן וההגברה של קרינת תכנית תגובה (STTARR) וסוכנויות המימון הקשורות אליה. אנו מודים לד"ר פיטר טונג, Dr.Iacovos מיכאל וDr.Andras נאגי לאספקת פלסמידים VEGFTrap והתיקונים לכתב היד שלהם ומשוב. המשך התמיכה והדיון מהצוות בBTRC כבר לא יסולא בפז ושהיינו רוצה לציון Dr.Abhijit גוהה לקלטו המדעי. עבודה מומנה על ידי NIH מענקי CIHR ו.
Materials
| Reagent | |||
| NODSCID mice | Jackson Lab | 001303 | 8 week old |
| B5/EGFP Mice | Jackson Lab | 003516 | |
| ACTB/DsRED mice | Jackson Lab | 005441 | |
| Tear Gel | Novartis | T296/2 | |
| 2% Lidocaine-Epinephrine | Bimeda MTC | 25SP | Use neat |
| Vetbond | 3M | 1469SB | |
| Self curing acrylic kit | Bosworth | 166260 | Use ~30% (w/v) |
| 10K MW Dextran-Alexa647 | Invitrogen | D22914 | Use @ 0.6 mg/kg in Saline |
| CD31-APC | BDPharmingen | 551262 | Use @ 0.3 mg/kg in Saline |
| AK-fluor (Fluorescein) 10% | AKORN inc. | NDC 17478-253-10 | Use @ 7.7 mg/kg in Saline |
| Betadine solution | Purdue Products | NDC 67618-150 | |
| Equipment | |||
| Fine Tweezers | VWR | 82027-402 | |
| Fine Dissection Scissors | VWR | 25870-002 | |
| 22G Needle | BD | 305156 | |
| 27G 0.5 ml TB syringe | BD | 305620 | |
| Handheld Micro-Drill | Fine Science Tools | 18000-17 | |
| 2.7 mm Trephine drillbit | Fine Science Tools | 18004-27 | |
| 10 μl 30G Hamilton syringe | Sigma Aldrich | 20909-U | |
| Glass Coverslip 3 mm | Warner Instruments | 64-0720 CS-3R | |
| Fluorescence goggles | BLS | FHS/T01 | Basic head frame |
| Stereotaxic frame | stoelting | 51950 | |
| Mouse restrainer for IV injection | Brain Tree Lifescience | MTI |
Referências
- Kienast, Y. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Medicine. 16, 116-122 (2010).
- Holtmaat, A. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat. Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Hansen-Algenstaedt, N., et al. Long-term observation reveals time-course-dependent characteristics of tumour vascularisation. Eur. J. Cancer. 41, 1073-1085 (2005).
- Kherlopian, A. R., et al. A review of imaging techniques for systems biology. BMC Systems Biology. 2, 74 (2008).
- Kedrin, D. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5, 1019-1021 (2008).
- Perentes, J. Y., et al. In vivo imaging of extracellular matrix remodeling by tumor-associated fibroblasts. Nature Methods. 6, 143-145 (2009).
- Brown, E., et al. Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation. Nature Medicine. 9, 796-800 (2003).
- Marker, D. F., Tremblay, M. -. E., Lu, S. -. M., Majewska, A. K., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Drew, P. J. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. -. B. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, 201-208 (2010).
- Burrell, K., Hill, R. P., Zadeh, G. High-resolution in-vivo analysis of normal brain response to cranial irradiation. PLoS ONE. 7, e38366 (2012).
- Tate, M. C., Aghi, M. K. Biology of angiogenesis and invasion in glioma. NURT. 6, 447-457 (2009).
- Aghi, M., Chiocca, E. A. Contribution of bone marrow-derived cells to blood vessels in ischemic tissues and tumors. Mol. Ther. 12, 994-1005 (2005).
- Nussenbaum, F., Herman, I. M. Tumor angiogenesis: insights and innovations. J. Oncol. 2010, 132641 (2010).
- Zhang, H. -. r. Incorporation of endothelial progenitor cells into the neovasculature of malignant glioma xenograft. J. Neuroonco. 93, 165-174 (2009).
- Blouw, B., et al. The hypoxic response of tumors is dependent on their microenvironment. Cancer Cell. 4, 133-146 (2003).
- Du, R., et al. HIF1alpha induces the recruitment of bone marrow-derived vascular modulatory cells to regulate tumor angiogenesis and invasion. Cancer Cell. 13, 206-220 (2008).
- Rajantie, I. Adult bone marrow-derived cells recruited during angiogenesis comprise precursors for periendothelial vascular mural cells. Blood. 104, 2084-2086 (2004).
- Shin de Patil, V. R., et al. marrow-derived lin(-)c-kit(+)Sca-1+ stem cells do not contribute to vasculogenesis in Lewis lung carcinoma. Neoplasia. 7, 234-240 (2005).
- Purhonen, S. Bone marrow-derived circulating endothelial precursors do not contribute to vascular endothelium and are not needed for tumor growth. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6620-6625 (2008).
- Aghi, M., Cohen, K. S., Klein, R. J., Scadden, D. T., Chiocca, E. A. Tumor stromal-derived factor-1 recruits vascular progenitors to mitotic neovasculature, where microenvironment influences their differentiated phenotypes. Pesquisa do Câncer. 66, 9054-9064 (2006).
- Burrell, K., Zadeh, G. . Molecular Mechanisms of Tumor Angiogenesis. , (2012).
- Thorball, N. FITC-dextran tracers in microcirculatory and permeability studies using combined fluorescence stereo microscopy, fluorescence light microscopy and electron microscopy. Histochemistry. 71, 209-233 (1981).
- Tolentino, M. J., et al. Angiography of fluoresceinated anti-vascular endothelial growth factor antibody and dextrans in experimental choroidal neovascularization. Arch. Ophthalmol. 118, 78-84 (2000).
- Holash, J. VEGF-Trap: a VEGF blocker with potent antitumor effects. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 11393-11398 (2002).
- Shinoda, J., et al. Fluorescence-guided resection of glioblastoma multiforme by using high-dose fluorescein sodium. , 1-7 (2003).
