TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. Por conseguinte, a preparação da amostra é de formato compatível com os instrumentos de manipulação mais líquidos, e pode ser usado para muitos médio para aplicações clínicas de alto rendimento e tipos de amostras.
TruTip é uma tecnologia de extracção de ácido nucleico simples, onde uma matriz de ligação poroso monolítico é inserida uma ponta de pipeta. A geometria do monólito pode ser adaptado para ponteiras específicas que variam de volume de 1,0 a 5,0 ml. A grande porosidade do monólito permite amostras viscosas ou complexas para passar facilmente através dele com contrapressão fluídica mínima. Fluxo bidireccional maximiza o tempo de residência entre o monolito e amostra, e permite grandes volumes de amostra a ser processado dentro de uma única TruTip. Os passos fundamentais, independentemente do volume de amostra, ou de geometria TruTip incluem a lise celular, a ligação para os poros interiores do TruTip monólito de ácido nucleico, embora a lavagem de componentes de amostra não ligados e tampões de lise, e eluindo os ácidos nucleicos purificados e concentrados em um tampão adequado. Os atributos e adaptabilidade de TruTip são demonstrados em três protocolos de processamento de amostras clínicas automatizados usando um epMotion Eppendorf 5070, Hamilton STAR e Starplus robôs de manipulação de líquidos, incluindo o isolamento de RNA a partir de aspirado nasofaríngeo, o isolamento de DNA genómico a partir de sangue total, e de extracção do ADN fetal e de enriquecimento a partir de grandes volumes de plasma materno (respectivamente).
Purificação de ácido nucleico, é necessário para os diagnósticos moleculares mais, a pesquisa usar apenas, e aplicações de ciências da vida. Várias abordagens têm emergido desde o tempo de extracções com fenol / clorofórmio, muitos dos quais se baseiam no princípio fundamental da ligação à sílica, na presença de sais caotrópicos um ácido nucleico. O processo de extração foi simplificada e automatizada através do uso de vários formatos e talão de membrana baseados, com filtros de rotação, esferas magnéticas e abordagens afins dominam setor de ciências da vida (ver exemplos em 2-13). Apesar de eficaz, as partículas e as membranas têm limitações conhecidas quando confrontado com matrizes clínicos desafiadores. Por exemplo, as membranas e colunas baseadas em grânulo são compatíveis, têm pequenas dimensões de poros (assim, pressões elevadas de volta), e requerem algum tipo de apoio, a fim de ser processada por um sistema de centrifugação ou de vácuo. As características físicas das membranas e resultam em colunas grânulofluídica resistência significativa, o que limita o tipo de amostras que podem ser processadas de forma eficiente sem obstruir o consumo, e / ou o volume total de amostras (de entrada), que pode ser uni-direccionalmente processados através do percurso de escoamento. Inversamente, as partículas magnéticas deve ser distribuído em toda a amostra por agitação. A necessidade de distribuir homogeneamente as partículas magnéticas dentro de uma solução limita o volume de amostra total de entrada que pode ser processado com consumíveis grânulo mais magnéticas. Atributos amostra clínica (tal como a viscosidade ou a complexidade) pode levar a uma concentração de partículas magnéticas ineficiente do lado de um tubo ou haste. Além disso, as partículas finas de sílica podem desprender das esferas durante o processo de extracção, a perder a sua magnetização e contaminar a amostra final.
A tecnologia TruTip foi desenvolvido para superar algumas dessas limitações de ácidos nucleicos de amostras de processamento e limitações 14. Ao incorporar um monólito poroso dentro de umponteira, fluídico contrapressão é reduzida, o que permite o controle de fluxo de vácuo (ou seja, pipeta de aspiração). Esta característica permite que o processo de extracção e de instrumentação necessária para purificar ácidos nucleicos a partir de tipos de amostra difíceis de ser muito simplificada (Figura 1). A geometria e porosidade do monólito é adaptada para minimizar o entupimento, enquanto que a espessura do monólito proporciona uma capacidade de ligação de ácido nucleico suficiente para volumes de amostra de 1,0 a 5,0 ml. Fluxo bidireccional da amostra, durante a aspiração e distribuição permite tempos de residência prolongados entre o extracto da amostra e o monólito de ligação para recuperação de ácido nucleico e a eluição eficiente e permite que volumes de amostra relativamente grandes a serem processados que exceda a capacidade do volume da ponta da pipeta em si. Nós relatamos anteriormente, o desenvolvimento e aplicação de um procedimento TruTip manual para purificar RNA de gripe a partir de amostras de nasofaringe usando uma única ou multi-canal Rainin pipeta 15. Eficiências de extracção equivalentes, foram obtidas entre automatizado QIAcube e métodos TruTip manuais em 10 6 cópias do gene da gripe A por ml aspirado nasofaríngeo. O objetivo deste estudo foi demonstrar os procedimentos de média e alta taxa de transferência, automatizados TruTip purificação de ácidos nucleicos para aspirado nasofaríngeo (NPA) e outros tipos de amostras clínicas relevantes, utilizando robôs para manipulação de líquidos comumente encontrados em laboratórios clínicos de referência.
A simplicidade do conceito TruTip e fluxo de trabalho (Figura 1) torna prontamente adaptados, automatizado, eficiente e eficaz para um número de matrizes de amostras clínicas, os volumes de amostras de entrada, e os sistemas de manuseamento de líquidos. Deve ser reconhecido, contudo, que cada amostra clínica é único, e variará de um para o outro na viscosidade, partículas, muco, os contaminantes da superfície, microbianos e / ou fundos genéticos humanos. Dadas as variações esperadas na composição da amostra clínica e utilizações previstas para um protocolo de preparação da amostra TruTip automatizado, pode ser necessário modificar alguns passos em um procedimento TruTip, a fim de alcançar os resultados desejados para um tipo de amostra específica. Independentemente do tipo de amostra, no entanto, os parâmetros TruTip que normalmente têm o efeito mais significativo sobre a pureza de ácido nucleico e / ou recuperação incluem:
Devido à geometria, material da ponta de pipeta, e método de fixação dos braços robóticos de canal são únicos para cada fabricante do instrumento, um constructo TruTip diferente é necessária para cada sistema de manuseamento de líquidos. As dimensões do monólito TruTip (diâmetro, espessura e tamanho de poro) que se correlacionam com a capacidade de ligação de ácido nucleico (e eficiências de eluição), como é esperado para qualquer técnica de extracção em fase sólida. Enquanto grossas (> 4 mm) de matrizes pode ser incorporado em um 1 mL TruTip para aumentar a capacidade de ligação de ácido nucleico para as amostras de grandes volumes e / ou igualar a capacidade de ligação entre os formatos TruTip específicas, existe uma compensação entre a espessura TruTip e taxas de fluxo durante o passo inicial de ligação (na presença de lisados brutos). Assim, é por vezes vantajoso incorporar monólitos de maior diâmetro em pontas de pipetas de maior volume para os passos iniciais de um protocolo automático (por exemplo, </ Em> os 5 ml de Hamilton / Akonni TruTips para extrações de grande volume). Dadas as configurações TruTip específicas ditadas pelos fabricantes de robôs de manipulação de líquidos, no entanto, não necessariamente esperar rendimentos ácidos nucleicos TruTip ser idêntica em todas as plataformas de manuseio de líquidos de diferentes fabricantes, ou em diferentes tamanhos TruTip.
As amostras clínicas (por definição) irá conter quantidades significativas de DNA genómico humano, a menos que eles são adquiridos a partir de locais normalmente estéreis (por exemplo, fluido espinhal cerebral). Por vezes, o DNA genómico humano é desejada (tal como na Figura 6), enquanto que em outras aplicações, o DNA humano representa um fundo genómico indesejado (tal como para a Figura 5). A presença de ADN de fundo não é normalmente problemática contanto que a quantidade total de ácido nucleico na amostra não exceda a capacidade de ligação do monólito, e o ADN do fundo pode servir como um transportador, se o alvo desejado nucleicoácido está presente em quantidades vestigiais. O objectivo do protocolo de extracção de plasma de grande volume (Figura 7) é isolar (fragmentada) de ADN fetal na presença de um excesso de 10-20 vezes de ADN materno, o qual é semelhante ao objectivo a preparação da amostra de teste de doenças infecciosas, excepto que As sequências são altamente congruente e só pode ser distinguido por testes moleculares altamente específica e / ou o tamanho da discriminação. Neste caso, o ADN total em circulação é isolado utilizando 5 ml de uma TruTip, e o ADN fetal de alto peso molecular e de baixo peso molecular são separadas por meio de posterior subsequente ligação e eluição com um 1 ml TruTip alterando as condições do tampão de ligação. Separação por tamanhos e de enriquecimento selectivo de ácidos nucleicos alvo com base na sua ligação e as propriedades de eluição a um monolito de sílica é um modo significativamente diferente da acção que a alcançada por membranas ou colunas de exclusão de tamanho de spin. Tamanho de separação e enriquecimento do DNA microbiano a partir de ADN genómico humano pode ser umccomplished em futuras aplicações via personalizando ligação TruTip e buffers de eluição.
Os protocolos automatizados demonstrado aqui sublinhar a utilidade do próprio TruTip monólito para o processamento de diversas amostras clínicas, e como ele pode ser adaptado para grandes volumes específicos e robôs de manipulação de líquidos. Os métodos simplificados tipicamente resultar em protocolos de extracção mais rápido em comparação com outros sistemas automatizados. A simplicidade da tecnologia TruTip, no entanto, também oferece algumas vantagens de custo para os interessados na compra de um novo sistema de purificação, automatizado ácido nucleico, porque o hardware primário necessário para automatizar procedimentos TruTip é o próprio braço canal pipeta ao invés de barras magnéticas, sistemas de vácuo ou on-board centrífugas. Utilizando placas de reagentes pré-cheias também podem reduzir o espaço e consumíveis necessários, eo dobro do rendimento per prazo. Minimizando o espaço deck com protocolos TruTip também permite que os usuários avançados para integrar a montante ou dprocessos automatizados ownstream com o TruTip. Por exemplo solução easyBlood de Hamilton para fraccionar sangue total podem ser incorporados com o método de extracção TruTip automatizado, o que iria simplificar significativamente os processos de bio-bancárias. Processos pós-extração, como a quantificação de ácidos nucleicos, a normalização, a PCR set-up, ou sequenciamento de DNA também são facilmente integrados com TruTip nas maiores plataformas de manipulação de líquidos.
The authors have nothing to disclose.
Partes deste trabalho foram apoiados pelo National Institutes of Health (NIH), sob concessão R 44 AI072784. Agradecemos ao Dr. Kirsten St. George, Sara B. Griesemer, Daryl Lamson e Amy Dean, do Laboratório de Doenças Virais, Wadsworth Center, New York State Departamento de Saúde para virions gripe quantificados e acesso à clinicamente validado influenza em tempo real Os testes de PCR.
Reagent/Material | |||
TruTip Influenza Extraction Kit (EPM TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-11120 | |
95% Ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
99% Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-4L | |
DEPC-treated water | Life Technologies | AM9906 | |
Reagent Reservoir, 30 ml | Eppendorf | 960050100 | |
Deep well plate 96/2,000 μl | USA Scientific | 30502302 | |
epT.I.P.S. Motion Filtertips, 1,000 μl | Eppendorf | 960050100 | |
Equipment | |||
epMotion 5070 System | Eppendorf | 5070 000.000 | |
Dispensing tool TM1000-8 | 960001061 | ||
Reservoir rack | 960002148 | ||
Table 1. Reagents and equipment for automated RNA extraction from NPA. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip gDNA Blood Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | 300-20341 | |
95% ethanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC615110040 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
1 ml Hamilton filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235905 | |
1 ml Hamilton non-filtered CO-RE 96 tip rack | Hamilton Robotics, Inc. | 235904 | |
50 ml Reagent Trough | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
Deep Well 2 ml plate | USA Scientific | 1896-2800 | |
Nunc 96 DWP-2 ml | Thermofisher | 27874 | |
Reagent Trough | Fisher | 14-222-412 | |
Equipment | |||
Hamilton STAR System | Hamilton Robotics, Inc. | 173027 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173050 | |
1 ml 96-channel head | Hamilton Robotics, Inc. | 199090 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
Sample Carriers/Inserts | Hamilton Robotics, Inc. | 173400/182238 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
HHS2 Heater Shaker Unit | Hamilton Robotics, Inc. | 199033 | |
Rack Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
Table 2. Regents and equipment for 96-well genomic DNA extraction from whole blood. | |||
Reagent/Material | |||
TruTip R+D Circulating DNA Extraction Kit (Hamilton TruTips) | Akonni Biosystems, Inc. | Call to inquire | |
100% ethanol | Sigma-Aldrich | 459828-1L | |
Isopropanol | Acros Organics/ThermoFisher Scientific | AC327270010 | |
Proteinase K | AMRESCO LLC | E195 | |
Filtered 4 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 184022 | |
Unfiltered 1 ml Tips | Hamilton Robotics, Inc. | 235939 | |
96-Deep Well Plates | USA Scientific | 1896-2800 | |
50 ml Conical Tubes | Corning/ThermoFisher Scientific | 05-526B | |
50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 187297 | |
120 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 182703 | |
Large Volume 96-Pos Reagent Troughs | ThermoFisher Scientific | 14-222-412 | |
Equipment | |||
STARplus Autoload Workstation Base / Deck Module | Hamilton Robotics, Inc. | 173025/190012 | |
1 ml Independent Pipette Channels / Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 173081/173052 | |
5 ml Independent Channel / Modular Arm | Hamilton Robotics, Inc. | 184090/173050 | |
Plate Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182090 | |
Multiflex Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 188039 | |
Rack Carrier for 50 ml Reagent Troughs | Hamilton Robotics, Inc. | 188047 | |
120 ml Reagent trough carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 185290 | |
Tip Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182085 | |
50 ml Tube Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 182245 | |
24 Position Sample Carriers | Hamilton Robotics, Inc. | 173400 | |
32 Position Sample Carrier | Hamilton Robotics, Inc. | 173410 | |
Table 3. Reagents and equipment for large volume DNA extraction from plasma. |