Yılında Escape Davranış Optogenetic Uyarım<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Genetik olarak kodlanmış optogenetic araçları belirli nöronların noninvaziv düzenlenmesini sağlayan<em> Drosophila</em> Beyin. Bu tür araçlar olan aktivasyon belirli davranışları ortaya çıkarmak veya bastırmak için yeterli nöronlar belirleyebilir. Burada özgürce yürüyüş sinekler hedefli nöron olarak ifade edilir Channelrhodopsin2 aktive etmek için bir yöntem mevcut.
Abstract
Genetik olarak kodlanmış araçlar giderek artan sayıda Drosophila melanogaster 1 belirli nöronların nöral aktivitenin non-invaziv manipülasyon izin verdiği kullanılabilir hale gelmektedir. Bunların arasında en önemlisi parlak bir ışık kullanarak sağlam ve serbestçe hareket hayvan belirli nöronların aktivasyonu veya susturulması etkinleştirmek optogenetic araçları vardır. Channelrhodopsin (ChR2) mavi ışık ile aktive edildiği zaman, bu ifade nöronların depolarizasyon neden, bir ışık aktif katyon kanalı. ChR2 gibi CO 2 kaçınma, hortum uzatma ve dev-fiber aracılı irkilme tepkisi 2-4 gibi belirli davranışlar için kritik nöronlar belirlenmesi için etkili olmuştur. Bununla birlikte, aynı zamanda ChR2 teşvik fotoreseptör uyarmak için kullanılan yoğun ışık kaynağı olarak, bu teknikler, daha önce optogenetic görsel sisteminde kullanılan edilmemiştir. Burada, demo fototransdüksiyon bozar bir mutasyon ile optogenetic yaklaşım birleştirmeksinek optik lob, Foma-1 nöronlarda tezgah duyarlı nöronların bir küme aktivasyonunun nstrate, çarpışmayı önlemek için kullanılan bir kaçış davranışı sürebilirsin. Bu fototransdüksiyon kaskadı önemli bir bileşeni bir boş alleli kullanılan norpA geni tarafından kodlanan fosfolipaz C-β, kör sinekler vermek ve aynı zamanda Foma-1 ChR2 ifade sürmek için gal4-UAS transkripsiyon aktivatörü sisteminin kullanılması nöronlar. Bireysel sinekler mavi LED'ler ile çevrili küçük bir platform üzerine yerleştirilir. LED'ler yandığında, görsel tahrik tezgah-kaçış davranışına benzer bir şekilde, uçuş içine hızlı take-off uçar. Biz bu tekniği kolayca serbestçe sinek hareketli diğer davranışlarını incelemek için adapte edilebilir inanıyorum.
Introduction
Genetik olarak kodlanmış araçlar büyüyen cephanelik Drosophila melanogaster 1 belirli hücrelerde nöral aktivitenin işlemek için geliştirilmiştir. Bu araçlar sağlam ve serbestçe hareket hayvan belirli nöronların noninvaziv aktivasyonu veya susturulması etkinleştirin. Bu zamansal olarak kontrol edilen ve hızlı bir şekilde indüklenen olabilir çünkü bu arasında, Channelrhodopsin2 (ChR2), bir ışık ile aktive olan katyon kanalı, önemli avantajlar sunmaktadır. Zaman ekspres ChR2 hızla depolarize ve 3-5 yükseltilmiş ateş oranları sergilerler parlak mavi (470 nm) ışığa maruz nöronlar. Serbestçe hareket eden hayvanlar belirli nöronların Böyle hedeflenen aktivasyonu gibi CO 2 kaçınma 3, hortum uzatma 2,4, ve dev-fiber aracılı irkilme yanıtları 4 sıra davranışları özellikle nöronların yeterliliğini ortaya koymuştur. Bununla birlikte, ChR2 uyarmak için gerekli yoğun ışık kaynağı olarak da op uygulayarak, fotoreseptör teşvikgörsel sisteme togenetic teknikleri sınırlı kalmıştır. Fototransdüksiyon bozar bir mutasyon ile optogenetic yaklaşımla birleştirerek, biz sinek optik lob nöronların belirli bir küme aktivasyonu çarpışması 6 önlemek için kullanılan kaçış davranışının sürebilirsin olduğunu göstermiştir.
Çoğu, hepsi değilse de, görsel hayvanlar yaklaşan nesneler ile çarpışmaları önlemek için bir kaçış davranışı sergilerler. Giderek kötüleşen çarpışma sunulduğunda, sinekler Yürüyüş veya sabit, uzak yaklaşmakta çarpışma 7-9, uçuş içine take-off. Bu take-off take-off ve istikrarsız bir uçuş yörüngesini 10,11 öncesinde gündeme kanatları ile karakterizedir. Bu yanıt dev fiber aracılı irkilme tepkisi, kaldırdı kanatları önünde olmayan atlar ayrıdır ve genellikle bir serbest düşme takla 4,9 sonuçlanabilir. Uniqu olan optik lob, Foma-1 nöronlar içinde tezgah duyarlı nöronların belirli bir küme tespit ettikten sonraely yaklaşan nesnelerin kodlamak için ayarlanmış, biz sinek tezgah kaçış davranışları katılımlarını soruşturma istedi. İşte biz seçici bu nöronların etkinleştirmek ve sinek kaçış davranışı ortaya çıkarmak için optogenetics kullanımını göstermektedir.
Biz Foma-1 nöronlarda ChR2 ifade sürücü gal4-UAS transkripsiyon aktivatörü sistemini kullanın. ChR2 kofaktör all-trans-retinal gerektirir ve bu Drosophila merkezi sinir sisteminde düşük seviyelerde bulunan olarak sineklerin diyet takviye edilmelidir. Parlak ışık ChR2 aktive etmek için kullanılan ve sinekler kuvvetli phototactic davranışlarda olduğu gibi 3,4 12, biz uyarana görsel bir tepki olasılığını ortadan kaldırmak için çalıştı. Bunu yapmak için, biz fototransdüksiyon kaskad kritik bir bileşeni, fosfolipaz C-β kodlar norpA gen, bir null alleli için homozigot mutant olduğunu hayvanlar kullanılmaktadır. Böyle mutant sinekler Fotoreseptörler sorumluluğu edemiyoruzd 13 yakılır. Kaçış yanıt optogenetic stimülasyon test etmek için, tek bir sinek yalıtmak ve parlak mavi ışık içinde yıkanmak gerekir. Bunu yapmak için, biz pipet ipuçları bireysel sinekler yerleştirin. Bir pipet ucu sinek geotactically ucu kadar yürüyecek böyle ve dışarı dikdörtgen bir platform üzerine özel bir tutucu, yerleştirilir. Sinek serbestçe bu platformun üstünde dolaşmak mümkün. Platformu platformu üstüne odaklanmış dört mavi LED dizileri, her birinde 3 adet led ile çevrilidir. Sinek platformda sonra, LED'ler yanıyor ve sinek tepkisi, yüksek hızlı kamera 6 kullanılarak kaydedilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Biz parlak mavi ışık sinek yürürken serbestçe yıkanan tarafından kaçış davranışları optogenetic stimülasyonu göstermiştir. Bu yaklaşım kolayca serbestçe dolaştıklarını sineklerin diğer davranışlarını incelemek için adapte edilebilir ve sadece biz daha geniş bir alana kullanılan LED diziler döşeme daha büyük platformlar için ölçeklendirilebilir. Kullanıcı terzi, biz tarif ucuz kamera, ya da diğer mevcut kamera sistemleri ya kullanarak, görüntülerin kare hızı ve uzaysal…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Stanford Dekanlık Bursu (SEJdV), Sağlık Müdürü Pioneer Ödülü bir Ulusal Sağlık Enstitüleri (TRC DP0035350), bir McKnight Vakfı Scholar Ödülü (TRC) ve R01 EY022638 (TRC) tarafından finanse edildi.
Materials
| Reagent | |||
| All-trans Retinal | Advance Scientific & Chemical Inc | R3041 | |
| Equipment | |||
| Heat Sink 9.2 C/W | Luxeonstar | LPD30-30B | 30 mm square X 30 mm high |
| Carclo 18 ° Tri-Lens | Luxeonstar | 10507 | |
| Blue Rebel LED on Tri-Star Base | Luxeonstar | MR-B0030-20T | 470 nm, 174 lm @ 700 mA. |
| 700 mA BuckPuck DC Driver | Luxeonstar | 3021-D-E-700 | |
| Wiring Harness for BuckPuck Driver | Luxeonstar | 3021-HE | |
| Pre-cut thermal adhesive tape | Luxeonstar | LXT-S-12 | 20 mm Hex Base |
| Snap-Loc Coolant Hose, ¼” ID | McMaster-Carr | 5307K49 | |
| Snap-Loc Coolant Hose Connector | McMaster-Carr | 5307K39 | ¼” NPT Male |
| Laboratory Grade Switching Mode Programmable DC Power Supply | BK Precision | 1698 | |
| Exilim camera | Casio | EX-FH20 |
Referências
- Venken, K., Simpson, J., Bellen, H. Genetic manipulations of genes and cells in the nervous system of the fruit fly. Neuron. 72, 202-230 (2011).
- Gordon, M., Scott, K. Motor control in a Drosophila taste circuit. Neuron. 61, 373-384 (2009).
- Suh, G. S. B., et al. Light activation of an innate olfactory avoidance response in Drosophila. Current Biology. 17, 905-908 (2007).
- Zhang, W., Ge, W., Wang, Z. A toolbox for light control of Drosophila behaviors through Channelrhodopsin 2-mediated photoactivation of targeted neurons. European Journal of Neuroscience. 26, 2405-2416 (2007).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Science. 100, 13940-13945 (2003).
- de Vries, S., Clandinin, T. Loom-sensitive neurons link computation to action in the Drosophila visual system. Current Biology. 22, 353-362 (2012).
- Card, G. Escape behaviors in insects. Current Opinion in Neurobiology. 22, 1-7 (2012).
- Card, G., Dickinson, M. H. Visually mediated motor planning in the escape response of Drosophila. Current Biology. 18, 1300-1307 (2008).
- Fotowat, H., Fayyazuddin, A., Bellen, H. J., Gabbiani, F. A novel neuronal pathway for visually guided escape in Drosophila melanogaster. Journal of Neurophysiology. 102, 875-885 (2009).
- Card, G., Dickinson, M. H. Performance trade-offs in the flight initiation of Drosophila melanogaster. The Journal of Experimental Biology. 211, 341-353 (2008).
- Hammond, S., O’Shea, M. Escape flight initiation in the fly. Journal of Comparative Phsyiology A. 193, 471-476 (2007).
- Benzer, S. Behavioral mutants of Drosophila isolated by countercurrent distribution. PNAS. 58, 1112-1119 (1967).
- Bloomquist, B., et al. Isolation of a putative phospholipase C gene of Drosophila, norpA, and its role in phototransduction. Cell. 54, 723-733 (1988).
- Gohl, D., et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns. Nature Methods. 8, 231-237 (2011).
- Zhang, F., et al. Red-shifted optogenetic excitation: a tool for fast neural control derived from Volvox cateri. Nature Neuroscience. 11, 631-633 (2008).
