Utviklingen av optogenetic metoder for å fremme eller hemme neuronal eksitabilitet med definerte bølgelengder av lys har gjort det mulig å studere funksjonen av distinkte populasjoner av nevroner i neural kretser kontrollerende ^{1 oppførsel, 19, 21.} Denne teknikken er ofte brukt til å aktivere grupper av nerveceller, men det kan også brukes til å aktivere enkelte nerveceller. Sebrafisk larver er spesielt mottagelig for disse metodene siden de er gjennomsiktig, utvikler nervesystemet raskt, og skape transgene dyr er rask og rutine. Må imidlertid betydelige tekniske hindrene må overvinnes for å pålitelig oppnå enkelt Nevron aktivering.

For å optimalisere en prosedyre for optogenetic aktivering av enkle sebrafisk nevroner, fokuserte vi på somatosensoriske nerveceller. Sebrafisk larver oppdage en rekke somatosensoriske stimuli ved hjelp av to populasjoner av nerveceller: trigeminal nevroner, som innerverer hodet, og Rohon-Beard (RB) nevroner, som innerverer resten av kroppen. Hver trigeminal og RB neuron projiserer en perifer axon som grener i stor utstrekning i huden for å oppdage stimuli og en sentral axon som kobles til nedstrøms nevrale kretser. Dyr reagerer når du trykker så tidlig som 21 timer etter befruktning (HPF), noe som indikerer at sammenhengende somatosensoriske kretser har dannet ^{5, 18.} Under larveutvikling minst noen trigeminal og RB nevroner synapse på Mauthner celle for å aktivere klassiske flukt svar, men samler bevis tyder på at det er flere klasser av somatosensoriske nevroner med ulike mønstre av tilkoblingsmuligheter som kan lokke fram variasjoner på flukt atferd ^{2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17.} Vår motivasjon for å utvikle denne metoden var å karakterisere de atferdsmessige funksjon av ulike klasser av somatosensoriske nevroner, men denne tilnærmingen kan i prinsippet brukes til å studere funksjonen til nesten alle nervecellen eller populasjon av nevroner i Larval sebrafisk.

Douglass et al. Tidligere beskrevet en fremgangsmåte for aktivering av Channelrhodopsin-2-uttrykkende somatosensoriske nevroner med blått lys, fremlokkende flykte atferd ^3. Deres tilnærming brukte en forsterker element fra isl1 genet til å kjøre uttrykk for ChR2-EYFP i somatosensoriske nerveceller. Denne transgenet, ble imidlertid rapportert å vise relativt svak fluorescens, krever samtidig injeksjon av en andre reporter til UAS :: GFP, tillate visualisering av celler som uttrykker ChR2-EYFP. Denne tilnærmingen ble brukt til å lokke fram atferd svar mellom 24-48 HPF, men kunne aldri lokke fram en reaksjon forbi 72 HPF. Således, mens denne metoden fungerer for å studere nevrale kretser på veldig tidlig larvestadier (24-48 HPF), er det utilstrekkelig for å karakterisere nevrale kretser og atferdsmessige reaksjoner på eldre larver, når flere ulike atferdsmessige reaksjoner er tydelige og nevrale kretser er mer moden.

Vi søkt åforbedre følsomheten av denne teknikken for å karakterisere funksjonen av subpopulasjoner av larve RB nerveceller. For å forbedre uttrykk vi brukte en somatosensoriske-spesifikk forsterker (CREST3) ²⁰ for å drive uttrykk for Lexa-VP16 og en strekning av Lexa operatør sekvenser (4xLexAop) ¹¹ å forsterke uttrykk for en fluorescently merket lysaktivert kanal. Denne konfigurasjonen forsterket uttrykk for kanalen, noe som eliminerer behovet for koordinering uttrykker en andre reporter og tillater oss å direkte bestemme den relative overflod av kanalen i hver neuron. Bruke Lexa / LexAop sekvens hadde den ekstra fordelen av å la oss til å introdusere transgene inn sebrafisk reporter linjer som bruker Gal4/UAS system. Forbigående ekspresjon av denne transgenet resulterte i varierende nivåer av uttrykk, men var vanligvis robust nok til å visualisere både cellen kroppen og aksonal projeksjoner av individuelle nevroner over flere dager. For å optimalisere sensitivligheten til å lyse vi brukte lyset aktiveres kanalen kokk, en channelrhodopsin variant som består av et fantasifoster av channelopsin-1 (Chop1) og channelopsin-2 (Chop2) med en crossover nettsted på helix sløyfe EF ^13. Denne kanalen er aktivert på samme bølgelengde som ChR2, men krever lavere lysintensitet for aktivering, noe som gjør den mer følsom enn andre brukte kanaler, inkludert ChR2. Kokken protein ble smeltet sammen til den røde fluorescerende protein, tdTomato, slik at vi kan skjerme for protein expression uten å aktivere kanalen. Som lyskilde, vi brukte en diode pumpet solid state (DPSS) laser koplet til en fiberoptisk kabel for å levere en presis, høyeffekts puls av blått lys til en spesifikk region av larvene. Dette tillater oss å fokusere laserlys på individuelle nevroner, som eliminerer behovet for å finne sjeldne transgene dyr som uttrykker en kanal i enkelt neuron. Ved hjelp av denne tilnærmingen, var vi i stand til å aktivere enkelt RB nevroner, ta atferdsresponsens med en høyhastighets videokamera og bilde de aktiverte nevronene i høy oppløsning med konfokalmikroskopi.