Optogenético La activación de las neuronas somatosensoriales pez cebra utilizando Chef-tdTomato

El desarrollo de métodos optogenética para promover o inhibir la excitabilidad neuronal con longitudes de onda definidas de luz ha permitido estudiar la función de las distintas poblaciones de neuronas en los circuitos neurales que controlan el comportamiento de ^{1, 19, 21.} Esta técnica se utiliza a menudo para activar grupos de neuronas, pero también puede ser usado para activar las neuronas individuales. Larvas de pez cebra son particularmente susceptibles a estos métodos ya que son translúcidas, su sistema nervioso se desarrolla rápidamente, y la creación de animales transgénicos es rápido y de rutina. Sin embargo, importantes obstáculos técnicos se debe superar para lograr fiablemente activación única neurona.

Para optimizar un procedimiento para la activación de las neuronas optogenético pez cebra individuales, nos hemos centrado en las neuronas somatosensoriales. Larvas de pez cebra detectar una variedad de estímulos somatosensoriales utilizando dos poblaciones de neuronas: las neuronas del trigémino, que inervan la cabeza, y Rohon-(BeardRB), las neuronas que inervan el resto del cuerpo. Cada trigémino y RB neurona proyecta un axón periférico que se ramifica extensamente en la piel para detectar los estímulos y un axón central que se conecta aguas abajo a los circuitos neuronales. Los animales responden a tocar tan pronto como 21 horas después de la fertilización (hpf), lo que indica que los circuitos somatosensoriales coherentes han formado ^{5, 18.} Durante el desarrollo larvario al menos algunas sinapsis las neuronas del trigémino y RB sobre la célula de Mauthner para activar respuestas clásicas de escape, pero la acumulación de evidencia sugiere que hay varias clases de neuronas somatosensoriales con diferentes patrones de conectividad que pueden provocar variaciones en el comportamiento de escape ^{2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17.} Nuestra motivación para el desarrollo de este método fue caracterizar la función de comportamiento de las diferentes clases de neuronas somatosensoriales, pero este enfoque podría en principio ser usado para estudiar la función de la neurona o casi cualquier población de neuronas en LARval pez cebra.

Douglass et al. Descrito previamente un método para activar canalrodopsina-2-expresando neuronas somatosensoriales con luz azul, provocando comportamiento de escape ^3. Su enfoque utiliza un elemento potenciador del gen ISL1 para conducir la expresión de ChR2-EYFP en las neuronas somatosensoriales. Este transgén, sin embargo, se informó de que muestran una fluorescencia relativamente débil, lo que requiere la co-inyección de un segundo reportero, UAS :: GFP, para permitir la visualización de células que expresan ChR2-EYFP. Este enfoque se utilizó para obtener respuestas de comportamiento entre 24-48 HPF, pero nunca pudo obtener una respuesta más allá de 72 HPF. Por lo tanto, mientras que este método funciona para el estudio de los circuitos neuronales en las fases larvarias tempranas (24-48 hpf), es insuficiente para la caracterización de circuitos neurales y las respuestas de comportamiento en las larvas mayores, cuando haya más diversas respuestas de comportamiento son evidentes y circuitos neuronales son más maduros.

Se buscómejorar la sensibilidad de esta técnica con el fin de caracterizar la función de las subpoblaciones de neuronas RB larvales. Para mejorar la expresión se utilizó un potenciador somatosensorial-específico (CREST3) ²⁰ para conducir la expresión de LexA-VP16 y un tramo de secuencias del operador LexA (4xLexAop) ¹¹ para amplificar la expresión de un marcado fluorescentemente y activado por la luz de canal. Esta configuración amplificado expresión del canal, eliminando la necesidad de co-expresión de un segundo reportero y que nos permite determinar directamente la abundancia relativa de la canal en cada neurona. Usando la secuencia de LexA / LexAOp tenía la ventaja adicional de que permite introducir el transgén en líneas indicadoras de pez cebra que utilizan el sistema GAL4/UAS. La expresión transitoria de este transgén resultó en niveles variables de expresión, pero generalmente era lo suficientemente robusta como para visualizar tanto el cuerpo de la célula y las proyecciones axonales de las neuronas individuales en varios días. Para optimizar la sensibilidaddad a la luz se utilizó la luz activado canal Chef, una variante canalrodopsina que consiste en una quimera de channelopsin-1 (Chop1) y channelopsin-2 (Chop2) con un sitio de cruce en hélice bucle EF ^13. Este canal se activa a la misma longitud de onda como ChR2, pero requiere una menor intensidad de luz para la activación, por lo que es más sensible que los otros canales de uso común, incluyendo ChR2. La proteína chef fue fusionado a la proteína fluorescente de color rojo, tdTomato, lo que nos permite cribar para la expresión de proteínas sin activar el canal. Como fuente de luz, se utilizó un diodo bombeado de estado sólido (DPSS) láser acoplado a un cable de fibra óptica para proporcionar una precisa, de alta potencia del pulso de luz azul a una región específica de las larvas. Esto nos permitió enfocar la luz láser sobre las neuronas individuales, eliminando la necesidad de encontrar raros animales transgénicos que expresan el canal en una sola neurona. El uso de este enfoque, hemos sido capaces de activar las neuronas individuales RB, registre la respuesta conductuals con una cámara de vídeo de alta velocidad, y la imagen de las neuronas activadas en alta resolución con microscopía confocal.