הפעלה של נוירונים Optogenetic דג זברה החושית באמצעות שף tdTomato
Summary
טכניקות Optogenetic הפכו אותו ניתן ללמוד על התרומה של נוירונים ספציפיים להתנהגות. אנו מתארים שיטה בדג זברת זחל להפעלת נוירונים חושיים יחידים להביע channelrhodopsin ריאנט (שף) עם מדינה-דיודה שאובה מוצקה ליזר (DPSS) ולהקליט את ההתנהגויות שהושרו עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה.
Abstract
דג זברת הזחל הם מתעוררים כמודל לתיאור ההתפתחות והתפקוד של מעגלים עצביים פשוטים. בשל ההפריה שלהם החיצוניות, ההתפתחות מהירה, והשקיפות, דג הזברה מתאים במיוחד גם לגישות optogenetic לחקור תפקוד מעגלים עצבי. בגישה זו, תעלות יונים רגישות לאור מבוטאות בתאי עצב מסוימים, ומאפשרים לניסוי כדי להפעיל או לעכב אותם ברצון ובכך להעריך את תרומתם להתנהגויות מסוימות. יישום שיטות אלו בדג זברת זחל הוא מושגית פשוט, אבל דורש אופטימיזציה של פרטים טכניים. כאן אנו מדגימים הליך לביטוי בגרסת channelrhodopsin נוירונים זחל דג זברה חושי, תאים בודדים מפעילות צילום, הקלטה ואת ההתנהגויות הנגזרות מכך. על ידי החדרה כמה שינויים לשיטות שנקבעו בעבר, גישה זו יכולה לשמש כדי לעורר תגובות התנהגותיות מתא עצב בודד הופעל עדללפחות 4 ימים לאחר ההפריה (DPF). באופן ספציפי, יצר transgene באמצעות חושי נוירון משפר, CREST3, לנהוג הביטוי מתויג channelrhodopsin הגרסה, שף tdTomato. הזרקת transgene זו לתוצאות עוברי שלב 1-תאים בביטוי פסיפס בנוירונים חושיים, שיכול להיות צלם עם מיקרוסקופיה confocal. מאיר זיהה תאים בבעלי חיים אלה עם אור ליזר DPSS ננומטר 473, מודרך דרך כבל סיב אופטי, מעורר התנהגויות שניתן להקליט במצלמת וידאו במהירות גבוהה ונותחו כמותית. טכניקה זו יכולה להיות מותאמת להתנהגויות לימוד שהושרו על ידי הפעלה כל נוירון דג זברה. שילוב של גישה זו עם הפרעות גנטיות או תרופתיות יהיה דרך רבה עצמה כדי לחקור היווצרות מעגל ותפקודו.
Introduction
פיתוח שיטות optogenetic לקידום או עיכוב רגישות עצבית באורכי גל מוגדר של אור אפשר ללמוד את הפונקציה של אוכלוסיות שונות של תאי עצב במעגלים עצביים השולטים 1 התנהגות, 19, 21. טכניקה זו משמשת לעתים קרובות כדי להפעיל קבוצות של תאי עצב, אבל זה גם יכול לשמש כדי להפעיל נוירונים בודדים. זחלי דג זברה הם בעיקר נוחות לשיטות אלה מכיוון שהם שקופים, מערכת העצבים שלהם מתפתחת במהירות, ויצירת חיות טרנסגניות היא מהירה ושגרתי. עם זאת, מכשולים טכניים משמעותיים שיש להתגבר אמין כדי להשיג הפעלת תא עצב יחידה.
כדי לייעל את ההליך להפעלת optogenetic של נוירונים בודדים דג זברה, התמקדו בנוירונים חושיים. זחלי דג זברה לזהות מגוון של גירויים חושיים באמצעות שתי אוכלוסיות של תאי עצב: עצב trigeminal, אשר מעצבבות את הראש וRohon-זקן (הנוירונים) RB, אשר מעצבבים את שאר הגוף. כל trigeminal וRB נוירון מקרין האקסון היקפי שסניפים רבים בעור כדי לזהות גירויים והאקסון מרכזי המתחבר למעגלים עצביים במורד זרם. בעלי חיים להגיב למגע מוקדם ככל 21 שעות שלאחר ההפריה (hpf), המציין כי המעגלים החושיים קוהרנטית יצרו 5, 18. במהלך התפתחות רימות לפחות חלק סינפסה נוירונים trigeminal וRB על תא מאוטנר להפעיל תגובות בריחה קלסיות, אך מצטברת ראיות מצביעה על כך שיש כיתות מרובות של נוירונים חושיים עם דפוסים שונים של קישוריות שעשויה לעורר וריאציות על התנהגות הבריחה 2, 4, 10, 12, 14, 15, 16, 17. המוטיבציה שלנו לפיתוח בשיטה זו הייתה לאפיין את התפקוד ההתנהגותי של סוגים שונים של תאי עצב חושיים, אך גישה זו יכולה בעיקרון לשמש כדי לחקור את הפונקציה של תא עצב או כל אוכלוסייה כמעט של הנוירונים בlarval דג זברה.
דאגלס et al. תאר שיטה בעבר להפעלת Channelrhodopsin-2-לבטא נוירונים חושיים עם אור כחול, לעורר התנהגות בריחה 3. הגישה שלהם משמשת אלמנט משפר מגן isl1 לנהוג ביטוי של ChR2-EYFP בנוירונים חושיים. transgene זה, עם זאת, דווח להצגת פלואורסצנטי החלש יחסית, שדורש שיתוף הזרקה של כתב שני, כטב"מ :: GFP, כדי לאפשר הדמיה של תאים לבטא ChR2-EYFP. גישה זו הייתה בשימוש כדי לעורר תגובות התנהגות בין 24-48 hpf, אבל אף פעם לא יכולה לעורר תגובת העבר 72 hpf. וכך, בעוד שיטה זו פועלת ללימוד מעגלים עצביים בשלבים מוקדמים מאוד זחל (24-48 hpf), אינו מתאים לאפיון מעגלים עצביים ותגובות התנהגותיות בזחלים מבוגרים יותר, כאשר תגובות התנהגותיות מגוונות יותר ניכרות והמעגלים עצביים הם יותר בוגרים.
אנחנו בקשנולשפר את הרגישות של טכניקה זו כדי לאפיין את הפונקציה של אוכלוסיות של נוירונים RB זחל. כדי לשפר את הביטוי שהיינו משפר חושי ספציפי (CREST3) 20 לנהוג ביטוי של LexA-VP16 ומתיחה של רצפי מפעיל כסה (4xLexAop) 11 כדי להגביר את הביטוי של ערוץ האור המופעל מתויג fluorescently. תצורה זו מוגברת ביטוי של הערוץ, ומבטל את הצורך לביטוי שיתוף כתב שני ומאפשר לנו לקבוע באופן ישיר את השפע היחסי של הערוץ בכל נוירון. שימוש ברצף LexA / LexAop היה יתרון נוסף, מאפשר לנו להציג את transgene לתוך שורות כתב דג זברה שמשתמשות במערכת Gal4/UAS. ביטוי זמני של transgene זה הביא לרמות שונות של ביטוי, אך בדרך כלל היה חזק מספיק כדי להמחיש היא את גוף התא ותחזיות axonal של נוירונים בודדים על פני כמה ימים. כדי לייעל sensitivity להדליק השתמשנו באור הופעל ערוץ שף, גרסת channelrhodopsin מורכב דמיוני של channelopsin-1 (Chop1) וchannelopsin-2 (Chop2) עם אתר מוצלב בסליל לולאת EF 13. ערוץ זה מופעל באותו האורך הגל כChR2, אבל דורש עוצמת אור נמוכה יותר להפעלה, מה שהופך אותו רגיש יותר מערוצים אחרים בשימוש נפוץ, כולל ChR2. חלבון השף הותך לחלבון פלואורסצנטי האדום, tdTomato, ומאפשר לנו להקרין לביטוי חלבון ללא הפעלת הערוץ. כמקור אור, השתמש דיודה שאובה ליזר מצב מוצק (DPSS) מצמיד את כבל סיב אופטי, כדי לספק דופק מדויק ובעל עצמה של אור הכחול לאזור מסוים של הזחלים. זה מאפשר לנו למקד את אור ליזר על נוירונים בודדים, ומבטל את הצורך במציאת בעלי חיים מהונדסים נדירים המבטאים את הערוץ בתא עצב יחיד. שימוש בגישה זו, שהיינו מסוגל להפעיל נוירונים RB בודדים, להקליט תגובה התנהגותיתשל עם מצלמת וידאו במהירות גבוהה, ותמונת הנוירונים מופעלים ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופיה confocal.
Protocol
Representative Results
Discussion
כבר תארנו את גישה להפעלת optogenetic של נוירונים בודדים בדג הזברה RB חי. השיטה שלנו מעסיקה transgenesis החולף להביע גרסה מתויגת fluorescently channelrhodopsin, 13 השף tdTomato, בנוירונים חושיים ספציפיים. גישה זו יכולה בקלות להיות מותאמת לשימוש באוכלוסיות תאים אחרות זחל דג זברה.
<p class="jove_content"…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים פומי קובל טוד Thiele וHerwigBaier (קליפורניה / מקס פלנק) עצה על ניסויי התנהגות וDPSS הליזר הקים; Heesoo קים וקיארה Cerri מקורס נוירוביולוגיה MBL לסיוע בניסויי השף tdTomato; PetronellaKettunen (אוניברסיטת גטבורג ) לשיתוף פעולה ראשוני על ניסויי optogenetic; BaljitKhakh, אריק הדסון, מייק Baca וג'ון מיליגן (UCLA) לייעוץ טכני, ורוג'ר צ'היין (UCSD) לשף tdTomato לבנות. עבודה זו נתמכה על ידי פרס NRSA (5F31NS064817) לAMSP ומענק של NSF (RIG: 0819010) ל-AS.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100×15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60×15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
Referências
- Arrenberg, A. B., Del Bene, F., Baier, H. Optical control of zebrafish behavior with halorhodopsin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (42), 17968-17973 (2009).
- Burgess, H. A., Johnson, S. L., Granato, M. Unidirectional startle responses and disrupted left-right co-ordination of motor behaviors in robo3 mutant zebrafish. Genes Brain Behav. 8 (5), 500-511 (2009).
- Douglass, A. D., Kraves, S., Deisseroth, K., Schier, A. F., Engert, F. Escape behavior elicited by single, channelrhodopsin-2-evoked spikes in zebrafish somatosensory neurons. Curr. Biol. 18 (15), 1133-1137 (2008).
- Downes, G. B., Granato, M. Supraspinal input is dispensable to generate glycine-mediated locomotive behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 66 (5), 437-451 (2006).
- Drapeau, P., Saint-Amant, L., Buss, R. R., Chong, M., McDearmid, J. R., Brustein, E. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog. Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Eisenhoffer, G. T., Rosenblatt, J. Live Imaging of Cell Extrusion from the Epidermis of Developing Zebrafish. J. Vis. Exp. (52), e2689 (2011).
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J. Vis. Exp. (26), e1217 (2009).
- Kague, E., Weber, C., Fisher, S. Mosaic Zebrafish Transgenesis for Evaluating Enhancer Sequences. J. Vis. Exp. (41), e1722 (2010).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating Chimeric Zebrafish Embryos by Transplantation. J. Vis. Exp. (29), e1394 (2009).
- Kohashi, T., Oda, Y. Initiation of Mauthner- or non-Mauthner-mediated fast escape evoked by different modes of sensory input. J. Neurosci. 28 (42), 10641-10653 (2008).
- Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat. Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
- Liao, J. C., Haehnel, M. Physiology of afferent neurons in larval zebrafish provides a functional framework for lateral line somatotopy. J. Neurophysiol. 107 (10), 2615-2623 (2012).
- Lin, J. Y., Lin, M. Z., Steinbach, P., Tsien, R. Y. Characterization of engineered channelrhodopsin variants with improved properties and kinetics. Biophys J. 96 (5), 1803-1814 (2009).
- Liu, K. S., Fetcho, J. R. Laser ablations reveal functional relationships of segmental hindbrain neurons in zebrafish. Neuron. 23 (2), 325-335 (1999).
- Liu, Y. C., Bailey, I., Hale, M. E. Alternative startle motor patterns and behaviors in the larval zebrafish (Danio rerio). J. Comp. Physiol. A. Neuroethol. Sens Neural. Behav. Physiol. 198 (1), 11-24 (2012).
- Palanca, A. M., Lee, S. L., Yee, L. E., Joe-Wong, C., Trinh, L. A., Hiroyasu, E., Husain, M., Fraser, S. E., Pellegrini, M., Sagasti, A. New transgenic reporters identify somatosensory neuron subtypes in larval zebrafish. Dev. Neurobiol. , (2012).
- Pujol-Martí, J., Zecca, A., Baudoin, J. P., Faucherre, A., Asakawa, K., Kawakami, K., López-Schier, H. Neuronal birth order identifies a dimorphic sensorineural map. J. Neurosci. 32 (9), 2976-2987 (2012).
- Saint-Amant, L., Drapeau, P. Time course of the development of motor behaviors in the zebrafish embryo. J. Neurobiol. 37 (4), 622-632 (1998).
- Szobota, S., et al. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. Neuron. 54 (4), 535-545 (2007).
- Uemura, O., et al. Comparative functional genomics revealed conservation and diversification of three enhancers of the isl1 gene for motor and sensory neuron-specific expression. Dev. Biol. 278 (2), 587-606 (2005).
- Wyart, C., Del Bene, F., Warp, E., Scott, E. K., Trauner, D., Baier, H., Isacoff, E. Y. Optogenetic dissection of a behavioural module in the vertebrate spinal cord. Nature. 461 (7262), 407-410 (2009).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
