요리사 tdTomato를 사용하여 Zebrafish Somatosensory의 뉴런의 Optogenetic 활성화
Summary
Optogenetic 기법은 가능한 행동에 특정 뉴런의 공헌을 공부 만들었습니다. 우리는 다이오드 펌핑 고체 상태 (DPSS) 레이저 channelrhodopsin 변형 (요리사)를 표현하고 고속 비디오 카메라로 elicited 행동을 녹화 한 somatosensory 뉴런을 활성화하기위한 애벌레의 zebrafish의 방법을 설명합니다.
Abstract
애벌레의의 zebrafish는 간단 신경 회로의 개발과 기능을 설명하기위한 모델로 등장하고 있습니다. 외부 기름지게, 신속한 개발 및 투명도로 인해 zebrafish는 특히 신경 회로 기능을 조사 optogenetic 접근 방식에 적합합니다. 이 방법에서는 빛에 민감한 이온 채널이 활성화하거나 억제를 마음대로하기 때문에 특정 행동에 대한 그들의 공헌을 평가하는 실험을 사용, 특정 뉴런에서 표현됩니다. 애벌레의 zebrafish에서 이러한 방법을 적용하는 것은 개념적으로 간단하지만 기술적 인 세부의 최적화가 필요합니다. 여기 애벌레의 zebrafish somatosensory의 뉴런, 사진 활성화 한 셀에 channelrhodopsin의 변형을 표현하고 그 결과 행동을 기록하기위한 절차를 보여줍니다. 이전에 설정 한 방법에 몇 가지 수정을 도입함으로써,이 방식은 최대 활성화 한 뉴런에서 행동 반응을 유도하는 데 사용할 수 있습니다최소 4 일 후 수정을 (dpf). 특히, 우리는 태그 channelrhodopsin 변형, 요리사 tdTomato의 표현을 유도 할 somatosensory 신경 세포 증강, CREST3를 사용하여 transgene을 만들었습니다. 공 촛점 현미경으로 이미징 할 수 있습니다 somatosensory 뉴런의 모자이크 표현, 1 세포 단계의 배아 결과에이 transgene를 주입. 조명은 473 nm의 DPSS 레이저의 빛이 동물에서 세포를 식별 광섬유 케이블을 통해 안내, 고속 비디오 카메라로 기록하고 양적 분석 할 수 동작을 elicits. 이 기술은 모든 zebrafish의 신경 세포를 활성화하여 elicited 학습 행동에 적용 할 수 있습니다. 유전자 또는 약리 섭동으로이 방법을 결합하면 회로 형성 및 기능을 조사 할 수있는 강력한 방법이 될 것입니다.
Introduction
빛의 정의 파장과 neuronal 흥분을 광고하거나 억제를위한 optogenetic 방법의 개발은 가능한 행동을 1, 19, 21 제어 신경 회로의 뉴런의 뚜렷한 인구의 기능을 공부 만들었습니다. 이 기술은 종종 뉴런의 그룹을 활성화하는 데 사용됩니다,하지만 또한 개별 뉴런을 활성화하는 데 사용할 수 있습니다. 그들은 반투명 때문에 Zebrafish 애벌레 이러한 방법으로 특히 의무가 있으며, 자신의 신경 시스템은 신속하게 개발하고, 유전자 변형 동물을 만드는 것은 빠르고 일상입니다. 그러나, 중요한 기술적 장애물이 안정적으로 하나의 신경 세포 활성화를 달성하기 극복해야합니다.
한 zebrafish의 뉴런의 optogenetic 활성화를위한 절차를 최적화하기 위해, 우리는 somatosensory 뉴런에 집중했다. 머리를 신경을 분포시키다 삼차 뉴런, 그리고 Rohon-비어드 (: Zebrafish의 애벌레는 두 뉴런의 인구를 사용하여 somatosensory 자극의 다양한 감지몸의 나머지 부분을 신경을 분포시키다 RB) 뉴런. 각 삼차와 RB 신경 세포는 피부에 광범위하게 가지 자극 및 다운 스트림 신경 회로에 연결 중심 축삭을 감지 할 수있는 주변 축삭을 계획했다. 동물은 코 히어 런트 somatosensory 회로, 18 5 형성 나타내는 이른 시간 후 수정을 (hpf) 21으로 만져 응답합니다. 애벌레의 개발 과정 적어도 Mauthner 셀로 일부 삼차와 RB 뉴런의 시냅스는 고전 탈출 응답을 활성화하지만, 증거를 축적하는 것은 탈출의 행동 2, 4에 변형을 유도 할 수 있습니다 연결성 다른 패턴으로 somatosensory 뉴런의 여러 클래스가 있다는 것을 시사하는 10, 12, 14, 15, 16, 17. 이 방법을 개발하기위한 우리의 동기는 somatosensory 뉴런의 서로 다른 클래스의 행동 기능을 특징하는 것이 었습니다하지만이 접근 방식은 원칙적으로 고맙다에서 뉴런의 거의 모든 신경 세포 나 인구의 기능을 연구하는 데 사용할 수 있습니다발 zebrafish.
더글라스 외가. 이전 활성화를위한 방법을 설명 Channelrhodopsin을-2-표현, 푸른 빛으로 somatosensory 뉴런을 탈출 행동 3을 도출하도록 의도. 그들의 접근 방식은 somatosensory 뉴런에 ChR2-EYFP의 표현을 유도 할 isl1 유전자에서 증강 요소를 사용했습니다. 이 transgene는하지만, 두 번째 기자의 공동 주사를 필요로 상대적으로 약한 형광을 표시하는 것으로보고되었습니다 UAS :: GFP는 ChR2-EYFP을 표현 세포의 시각화를 허용합니다. 이 접근 방식은 24-48 hpf 사이에 행동 반응을 유도하기 위해 사용되었지만, 72 hpf 과거의 응답을 이끌어내는 수 없다. 이 방법은 매우 일찍 애벌레의 단계 (24-48 hpf)에서 신경 회로를 공부를 위해 일 동안 따라서, 그것은 더 다양한 행동 반응이 명백하고 신경 회로가 더 성숙한 나이가 애벌레에서 신경 회로 및 행동 반응을 특성화에 불충분합니다.
우리는 모색애벌레의 RB의 뉴런의 subpopulations의 기능을 특성화하기 위해이 기법의 감도를 향상시킬 수 있습니다. 표현을 개선하기 위해 우리는 휘황 태그 가벼운 활성화 된 채널의 표현을 확대하려면 LexA-VP16의 표현과 LexA 운영자 시퀀스 (4xLexAop) 11의 스트레칭을 유도하기 위해 somatosensory 특정 증강 (CREST3) 20를 사용했습니다. 이 구성은 두 번째 기자가 공동 표현하고 우리가 직접 각각의 신경 세포에 채널의 상대적으로 풍부한을 결정 할 수 있도록에 대한 필요성을 제거, 채널의 표현을 증폭. LexA / LexAop 순서를 사용하면 우리가 Gal4/UAS 시스템을 사용 zebrafish 기자 라인으로 transgene을 소개 할 수있는 추가 혜택을했다. 이 transgene의 과도 표현은 표현의 수준을 변화의 결과 있지만, 일반적으로 몇 일 동안 전지 본체 및 개별 뉴런의 axonal 예측 모두를 시각화 할 수있을만큼 강력한했습니다. 민감한를 최적화 할 수빛으로 ity 우리는 채널 요리사, 나선형 루프 EF 13에서 교차 사이트와 channelopsin-1 (Chop1)과 channelopsin-2 (Chop2)의 키메라로 구성된 channelrhodopsin의 변형을 활성화 빛을 사용했습니다. 이 채널은 ChR2 같은 파장에서 작동하지만, ChR2 등 다른 일반적으로 사용되는 채널보다 더 민감하고, 활성화를위한 낮은 빛의 세기가 필요합니다. 요리사 단백질은 우리가 채널을 활성화하지 않고 단백질 표현 상영 할 수 있도록, 빨간 형광 단백질, tdTomato에 융합되었다. 광원으로, 우리는 다이오드는 애벌레의 특정 지역에 푸른 빛의 정확한, 고출력 펄스를 제공 할 수있는 광섬유 케이블에 연결된 고체 (DPSS) 레이저를 펌핑 사용됩니다. 이것은 우리가 하나의 뉴런에서 채널을 표현하는 희귀 한 유전자 변형 동물을 찾는에 대한 필요성을 제거, 개별 뉴런에 레이저 광을 포커싱 할 수있었습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는 하나의 RB의 뉴런을 활성화 행동 반응을 기록 할 수 있었다고속 비디오 카메라 및 이미지 공 촛점 현미경과 고해상도의 활성화 뉴런과 s입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 라이브 zebrafish의 단일 RB의 뉴런의 optogenetic 활성화를위한 접근 방식을 설명하고 있습니다. 우리의 방법은 특정 somatosensory 뉴런에서 휘황 태그 channelrhodopsin의 변형, 요리사 tdTomato 13, 표현할 수있는 과도 transgenesis을 사용합니다. 이 접근 방식은 쉽게 다른 애벌레의 zebrafish 세포 집단에 사용하기 위해 적용 할 수 있습니다.
이 방법을 사용하여 우리는 지속적으?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 레이저가 설정 행동 실험과 DPSS에 대한 조언을 Fumi Kubo, 토드 Thiele과 HerwigBaier (UCSF / 최대 플랑크 연구소) 감사, 요리사 tdTomato 실험에 도움을위한 MBL 신경 생물학 과정에서 희수 킴과 키아라 Cerri, PetronellaKettunen (예테보리 (Gothenburg) 대학 ) 초기 optogenetic 실험에 협력, BaljitKhakh, 에릭 허드슨, 마이크, Baca 및 기술 조언 존 Milligan (UCLA) 및 요리사 tdTomato에 대한 로저 Tsien (UCSD) 구성합니다. AS :이 작품은 NSF에서 AMSP와 부여 NRSA (5F31NS064817) 수상 (0,819,010 장비)에 의해 지원되었다.
Materials
| Name of Reagent/Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Glass Pasteur pipette | Fisher | 1367820B | or equivalent (10-15 mm diameter) |
| 200 μm optic fiber | ThorLabs | AFS200/220Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| 50 μm optic fiber | ThorLabs | AFS50/125Y-CUSTOM | Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030 |
| Adjustable Stripping Tool | ThorLabs | AFS900 | or Three-Hole Stripping Tool (FTS4) |
| Diamond Wedge scribe | ThorLabs | S90W | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-97 | or equivalent |
| Borosilicate glass tubing with filament | Sutter Instruments | BF-100-78-10 | |
| Injection mold | n/a | n/a | Figure 5 |
| 1.5 ml centrifuge tubes | Any | Any | |
| Petri dish (100×15 mm) | Any | Any | |
| Petri dish (60×15 mm) | Any | Any | |
| Pressure injector | ASI | MPPI-3 | or equivalent |
| Micromanipulator and metal stand | Narashige | M152 | or equivalent |
| Disposable plastic pipettes | Fisherbrand | 13-711-7 | or equivalent |
| Poker (Pin holder and Insect pin) | Fine Science Tools, Inc. | 26018-17 and 26000-70 | or equivalent |
| Forceps | Fine Science Tools, Inc. | 11255-20 | or equivalent |
| Microloader pipette tips | Eppendorf | 9300001007 | |
| 28.5 °C incubator | any | any | |
| 42 °C heat block | Any | Any | |
| Non-Sterile scalpel blades #11 | Fine Scientific Tools, Inc. | 10011-00 | or equivalent |
| Dissecting scope | Zeiss | Stemi | or equivalent |
| Fluorescent dissecting scope with standard filter | Any | any | or equivalent |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 510 or 710 | or equivalent with lasers for GFP and RFP, and 10x, 20x and 40x objectives |
| High speed camera | AOS Technologies, Inc. | X-PRI (130025-10) | or equivalent |
| 473 nm portable laser | Crystal lasers | CL-473-050 | or higher power, with TTL option |
| S48 Stimulator | Astro-Med, Inc. Grass Instrument division | S48K | or equivalent |
| FC/PC to FC/PC mating sleeve | ThorLabs | ADAFC1 | May need for optic cable connection |
| Laser Safety Glasses | ThorLabs | LG10 | or equivalent |
| 24 culture plates | Genesee | 25-102 | or equivalent |
| Single depression slides | Fisher | S175201 | Or equivalent |
| Reagent | |||
| Instant ocean | Aquatic Ecosystems | IS50 | |
| Methylene blue | Fisher | S71325 | |
| Phenol red | Sigma | P4758 | |
| Agarose | EMD | 2125 | or equivalent |
| Low Melt agarose | Sigma | A9045 | or equivalent |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Tricaine | Sigma | A5040 | |
| blue/embryo water | 10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue |
||
| phenol red | (5 mg/ml in 0.2 M KCl) | ||
| 100x PTU | 0.150 g PTU 50 ml ddH2O dissolve at 70 °C, shake often aliquot and store at -20 °C |
||
| 1x PTU | 1 ml 100x PTU 99 ml blue/fish water |
||
| Tricaine stock solution | 400 mg tricaine 97.9 ddH2O |
||
| ~2.1 ml 1M Tris, pH9.0 | adjust pH to ~7.0 store in 4 °C or -20 °C for long term storage |
Referências
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