Summary

Gezielte Labeling von Neuronen in einem bestimmten Functional Micro-Domäne des Neocortex durch Kombination Intrinsic Signal-und Zwei-Photonen-Imaging

Published: December 12, 2012
doi:

Summary

Es wird ein Verfahren zur Markierung von Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoffen in vorbestimmten funktionellen Mikrodomänen des Neokortex beschrieben. Zuerst wird intrinsische Signal Abbildungsoptik verwendet werden, um eine funktionelle Karte zu erhalten. Dann Zweiphotonenmikroskopie wird Etiketts und Bild Neuronen innerhalb eines Mikro-Domäne von der Karte verwendet.

Abstract

In der primären Sehrinde des Nicht-Nagetier Säugetieren, sind Neurone nach ihrer Präferenz für Stimulus-Features wie Ausrichtung 1-4, Richtung 5-7, okuläre Dominanz 8,9 und binokulare Disparität 9 gruppierten. Orientierungsselektivität ist das am besten untersuchte und eine kontinuierliche Funktion der Karte mit einem quasi-periodischen Layout für bevorzugte Orientierung vorhanden ist über den gesamten primären Sehrinde 10,11. Die Integration der synaptischen, Mobilfunk-und Netzwerk-Beiträge, die Stimulus-selektive Reaktionen in diesen funktionellen Karten führen erfordert die Hybridisierung von bildgebenden Verfahren, die sub-micron überspannen bis Millimeter räumlichen Skalen. Bei herkömmlichen intrinsische Signal optische Bildgebung kann die gesamte Anordnung der Funktionskarten über die gesamte Oberfläche des visuellen Kortex 12 bestimmt werden. Die Entwicklung der in vivo Zwei-Photonen-Mikroskopie mit Calcium-sensitiven Farbstoffen ermöglicht es, die SYNAPT bestimmenIC-Eingang ankommen einzelnen dendritischen Dornen 13 oder Rekord-Aktivität gleichzeitig aus Hunderten von einzelnen neuronalen Zellkörper 6,14. Folglich Kombinieren intrinsische Signal Bilderzeugung mit der Sub-Mikrometer Ortsauflösung Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, genau festzustellen, welcher dendritischen Zellen Segmente und an das Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte in der Großhirnrinde beitragen. Hier zeigen wir, eine hohe Ausbeute-Verfahren zum schnellen Gewinnung eines kortikalen Orientierungskarte und die eine spezifische Mikro-Domäne in diesem funktionellen Karte zur Markierung mit Fluoreszenzfarbstoffen Neuronen in einem nicht-Nagetier-Säuger. Mit dem gleichen Mikroskop für Zwei-Photonen-Bildgebung verwendet, wir erzeugen zunächst eine Orientierung Karte mit intrinsische Signal optische Bildgebung. Dann werden wir zeigen, wie man ein Mikro-Domain von Interesse mit einer Mikropipette mit Farbstoff entweder Label geladen gezielt eine Population von neuronalen Zellkörper oder Etikett eines einzelnen Neurons, dass Dendriten, Stacheln und Axone sichtbar sindvivo. Unsere Verbesserungen gegenüber bisherigen Methoden ermöglichen eine Untersuchung der neuronalen Struktur-Funktions-Beziehungen mit sub-zellulärer Auflösung im Rahmen des Neokortex funktionalen Architekturen.

Protocol

Ein. Chirurgische Vorbereitung Induzieren Anästhesie und kontinuierlich überwachen Herzfrequenz, endexspiratorischen CO 2, EEG und Temperatur. Alle Verfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee der Medical University of South Carolina genehmigt und wurden auf die wir zuvor veröffentlichten 9,15 basiert. Setzen Sie den dorsalen Oberfläche des Schädels, indem die Haut mit einem Skalpell. Sezieren die Bindegewebe über dem Knochen mit einer Brudon Küre…

Representative Results

Um die Genauigkeit der Farbstoff Markierungsverfahren veranschaulichen, gezielte wir den kleinsten Mikro-Domäne von irgendeinem bekannten funktionellen Karte im nicht-Nagetier Neocortex. Dünn ganzen Orientierungsplan in der primären Sehrinde unterbrochen sind Singularitäten. Diese treten an Stellen, wo alle bevorzugten Orientierungen konvergieren, so dass in Falschfarben Karten der bevorzugten Orientierung, die Regionen um die Singularität aussehen "Windräder" (2A-B). Ein Windrad pro Kra…

Discussion

Wir präsentieren eine Methode, um die Etikettierung von neuronalen Zellkörper (oder Dendriten und Axone) in vorgegebenen funktionalen Mikrodomänen des Neokortex Ziel. Zusammenführen intrinsische Signal optischen Bildgebung mit Zweiphotonenmikroskopie bietet die Möglichkeit, zu bestimmen, welche Zellen Synapsen und tragen zur Mikro-Domäne von irgendeinem der funktionellen Karte, ob neuronalen Selektivität korreliert mit der Position des Neurons in einem funktionellen Karte, und die neuronale Schaltungskomponenten …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gnade Dion für das Verfolgen der Dendriten in 5A gezeigt;; Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus dem National Eye Institute R01EY017925 und R21EY020985 und Finanzierung von den Dana & Whitehall Foundations PK Wir danken auch Matthew Petrella für die Unterstützung bei chirurgischen Eingriffen unterstützt und Pratik Chhatbar für Anmerkungen zum Manuskript.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalogue Number Comments
      1. Life support/experiment prep
Isoflurane Webster Vet NDC 57319-474-05  
Isoflurane vaporizer Midmark VIP 3000  
Feedback regulated heating blanket Harvard Apparatus 50-7079F  
ECG monitor Digicare Biomedical LifeWindow Lite  
EEG amplifier A-M Systems 1800  
EEG display monitor Hewlett Packard 78304A  
End tidal CO2 monitor Respironics Novametrix Capnoguard 1265 Optimize ventilation
Carbide drill burrs for drilling bone Henry Schein fine (0.5 mm tip) and coarse (1.25 mm tip)  
Cement for headplate/chamber Dentsply 675571, 675572  
Black Powder Tempera Paint Sargent Art Inc. 22-7185 Add to cement to improve light shielding and reduce reflections
Agarose – Type III-A Sigma A9793 For minimizing pulsations during intrinsic signal and two-photon imaging
Coverglass: 5 or 8 mm diameter, 0.17 mm thickness World Precision Instruments 502040, 502041 For minimizing pulsations during imaging, the coverglass may be cut as needed
Brudon curettes George Tiemann 105-715-0, 105-715-3 Cleaning skull surface
Bone wax Ethicon W31G Quickly stop bleeding
Cotton Tipped Applicator Electron Microscopy Sciences 72308-05 Clean and dry bone surface
Dumont #5CO Forceps Fine Science Tools 11295-20 Grab individual layers of dura or pia
Vannas Spring Scissors Fine Science Tools 15000-03 Cut dura
Gelfoam Pfizer 09-0396-05 To stop bleeding on the dura
Absorption spears Fine Science Tools 18105-01 Ultra-fast and lint-free wicking of CSF
Blackout material Thorlabs BK5 Shield craniotomy
      2. Dye preparation / injection
Dimethyl Sulphoxide (DMSO) Sigma D2650  
Pluronic Sigma P2443  
Oregon Green 488 Bapta-1 AM Invitrogen O6807 Calcium indicator
Alexa Fluor 594 Invitrogen A10438  
Centrifugal filter (0.45 μm pore size) Millipore UFC30HV00 To remove impurities before injection
Glass pipette puller Sutter Instruments P97  
Borosilicate glass filamented capillary (1.5 mm outer diameter) World Precision Instruments 1B150F-4 Dye ejection pipette
Microloader Eppendorf 5242 956 003 For loading dye into pipette
Micromanipulator Sutter Instruments MP-285 To position pipette
Pressure pulse controller Parker Hannifin PicoSpritzer III For pressure injection of the dye
Single-cell electroporator Molecular Devices Axoporator 800A For electroporation of the dye
      3. Intrinsic imaging
4x Objective (0.13 NA, 17 mm WD) Olympus UPLFLN4X  
Intrinsic hardware / software Optical Imaging Inc. Imager 3001 / VDAQ VDAQ software is used for episodic imaging
CCD Camera Adimec Adimec-1000  
Light source power supply KEPCO ATE 15-15M  
Light source Optical Imaging Inc. HAL 100 Light intensity at the cortical surface is 3-5 mW
Green filter (for vascular image) Optical Imaging Inc. λ = 546 nm (bandpass 30 nm) For reference image of surface vasculature
Red filter (for intrinsic signal) Optical Imaging Inc. λ = 630 nm (bandpass 30 nm) To collect intrinsic signals
Heat filter Optical Imaging Inc. KG-1  
      4. Two-photon rig/imaging
Two-photon microscope and software Prairie Technologies   See Shen et al. 2012 for light path, filters and laser power
Ti:Sapphire laser Spectra-Physics Mai Tai XF  
20x (0.5 NA; 3.5 mm WD) Olympus UMPLFLN20X 0.5 NA objective is used only for aligning pipette over the craniotomy (not for two photon imaging)
20x (1.0 NA; 2.0 mm WD) Olympus XLUMPLFLN20X  
40x (0.8 NA; 3.3 mm WD) Olympus LUMPLFLN40X/IR  
Air table Newport ST-200 Isolates preparation from external vibrations
xy stage Mike’s Machine Co. (Attleboro, MA)   Experimental subject and Sutter micromanipulator placed on xy stage
     
Recipes
Artificial Cerebro-Spinal Fluid NaCl (135 mM), KCl (5.4 mM), MgCl2 (1.0 mM), CaCl2 (1.8 mM), HEPES (5 mM), pH 7.4
Pipette Solution14 NaCl (150 mM), KCl (2.5 mM), HEPES (10 mM), pH 7.4

Referências

  1. Blasdel, G. G., Salama, G. Voltage-sensitive dyes reveal a modular organization in monkey striate cortex. Nature. 321, 579-585 (1986).
  2. Grinvald, A., Lieke, E., Frostig, R. D., Gilbert, C. D., Wiesel, T. N. Functional architecture of cortex revealed by optical imaging of intrinsic signals. Nature. 324, 361-364 (1986).
  3. Bonhoeffer, T., Grinvald, A. Iso-orientation domains in cat visual cortex are arranged in pinwheel-like patterns. Nature. 353, 429-431 (1991).
  4. Ohki, K., et al. Highly ordered arrangement of single neurons in orientation pinwheels. Nature. 442, 925-928 (2006).
  5. Shmuel, A., Grinvald, A. Functional organization for direction of motion and its relationship to orientation maps in cat area 18. J. Neurosci. 16, 6945-6964 (1996).
  6. Ohki, K., Chung, S., Ch’ng, Y. H., Kara, P., Reid, R. C. Functional imaging with cellular resolution reveals precise micro-architecture in visual cortex. Nature. 433, 597-603 (2005).
  7. Li, Y., Van Hooser, S. D., Mazurek, M., White, L. E., Fitzpatrick, D. Experience with moving visual stimuli drives the early development of cortical direction selectivity. Nature. 456, 952-956 (2008).
  8. Bonhoeffer, T., Kim, D. S., Malonek, D., Shoham, D., Grinvald, A. Optical imaging of the layout of functional domains in area 17 and across the area 17/18 border in cat visual cortex. Eur. J. Neurosci. 7, 1973-1988 (1995).
  9. Kara, P., Boyd, J. D. A micro-architecture for binocular disparity and ocular dominance in visual cortex. Nature. 458, 627-631 (2009).
  10. da Costa, N. M., Martin, K. A. Whose Cortical Column Would that Be. Frontiers in Neuroanatomy. 4, 16 (2010).
  11. Kaschube, M., et al. Universality in the evolution of orientation columns in the visual cortex. Science. 330, 1113-1116 (2010).
  12. Villeneuve, M. Y., Vanni, M. P., Casanova, C. Modular organization in area 21a of the cat revealed by optical imaging: comparison with the primary visual cortex. Neurociência. 164, 1320-1333 (2009).
  13. Chen, X., Leischner, U., Rochefort, N. L., Nelken, I., Konnerth, A. Functional mapping of single spines in cortical neurons in vivo. Nature. 475, 501-505 (2011).
  14. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 7319-7324 (2003).
  15. Shen, Z., Lu, Z., Chhatbar, P. Y., O’Herron, P., Kara, P. An artery-specific fluorescent dye for studying neurovascular coupling. Nat. Methods. 9, 273-276 (2012).
  16. Nevian, T., Helmchen, F. Calcium indicator loading of neurons using single-cell electroporation. Pflugers Archiv. 454, 675-688 (2007).
  17. Kitamura, K., Judkewitz, B., Kano, M., Denk, W., Hausser, M. Targeted patch-clamp recordings and single-cell electroporation of unlabeled neurons in vivo. Nat. Methods. 5, 61-67 (2008).
  18. Pohl-Guimaraes, F., Krahe, T. E., Medina, A. E. Early valproic acid exposure alters functional organization in the primary visual cortex. Exp. Neurol. 228, 138-148 (2011).
  19. Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471, 177-182 (2011).
  20. Rochefort, N. L., et al. Development of direction selectivity in mouse cortical neurons. Neuron. 71, 425-432 (2011).
  21. Mrsic-Flogel, T. D., et al. Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity. Neuron. 54, 961-972 (2007).
  22. Bonhoeffer, T., Grinvald, A., Toga, A. W., Mazziotta, J. C. Optical Imaging Based on Intrinsic Signals. Brain mapping: The Methods. , 55-97 (1996).
  23. Kerr, J. N., Greenberg, D., Helmchen, F. Imaging input and output of neocortical networks in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 14063-14068 (2005).
  24. Hofer, S. B., et al. Differential connectivity and response dynamics of excitatory and inhibitory neurons in visual cortex. Nat. Neurosci. 14, 1045-1052 (2011).

Play Video

Citar este artigo
O’Herron, P., Shen, Z., Lu, Z., Schramm, A. E., Levy, M., Kara, P. Targeted Labeling of Neurons in a Specific Functional Micro-domain of the Neocortex by Combining Intrinsic Signal and Two-photon Imaging. J. Vis. Exp. (70), e50025, doi:10.3791/50025 (2012).

View Video