Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons

Published: November 20, 2012 doi: 10.3791/4450
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Jackson Laboratory

Summary

Ao marcar os domínios extracelulares dos receptores de membrana com pHluorin superecliptic, e por imagiologia estes receptores de fusão em neurónios de rato em cultura, pode-se visualizar directamente os eventos de inserção individuais vesiculares dos receptores na membrana plasmática. Esta técnica será útil para elucidar os mecanismos moleculares que regulam a inserção do receptor para a membrana plasmática.

Abstract

Uma melhor compreensão dos mecanismos que regem o tráfico receptor entre a membrana do plasma (PM) e compartimentos intracelulares requer uma abordagem experimental, com excelentes resoluções espaciais e temporais. Além disso, esta abordagem também deve ter a capacidade de distinguir os receptores localizados na PM daqueles em compartimentos intracelulares. Mais importante ainda, a detecção de receptores de uma vesícula única requer excelente sensibilidade de detecção, uma vez que cada vesícula leva apenas um pequeno número de receptores. Abordagens normalizadas para examinar o tráfico receptor incluem a biotinilação da superfície seguido de detecção bioquímica, que carece tanto as resoluções necessárias espaciais e temporais, e exame de microscopia de fluorescência de receptores de superfície, o que requer immunolabeled fixação química de células e, portanto, carece de resolução temporal suficiente 1-6. Para superar essas limitações, nós e outros têm desenvolvido e utilizado um novo stratégia que permite a visualização da inserção dinâmica de receptores para a PM, com excelentes resoluções espaciais e temporais 7-17. A abordagem inclui a marcação de uma GFP sensível ao pH, o pHluorin superecliptic 18, para o domínio N-terminal extracelular de receptores. Superecliptic pHluorin tem a propriedade única de ser fluorescente a pH neutro e não fluorescente a pH ácido (pH <6,0). Portanto, os receptores marcados são não-fluorescente quando dentro do lúmen ácida tráfico de vesículas intracelulares ou compartimentos endossomais e tornam-se facilmente visualizado apenas quando exposto ao ambiente extracelular pH neutro, na superfície exterior do PM. Nossa estratégia, consequentemente, permite-nos distinguir receptores de superfície PM daqueles dentro de vesículas tráfico intracelular. Suficientes para alcançar resoluções espaciais e temporais, bem como a sensibilidade necessária para estudar o tráfico dinâmica dos receptores, foram empregados interna total reflectemion microscopia fluorescente (TIRFM), o que nos permitiu obter a melhor resolução espacial da imagem óptica (~ 170 nm), a resolução temporal do vídeo de taxa de microscopia (30 quadros / seg), e a sensibilidade para a detecção de fluorescência de uma única GFP molécula. Pela imagem pHluorin-marcado receptores sob TIRFM, fomos capazes de visualizar diretamente eventos receptores individuais inserção na PM em neurônios cultivados. Esta abordagem de imagem pode, potencialmente, ser aplicada a qualquer proteína de membrana com um domínio extracelular que poderiam ser marcadas com pHluorin superecliptic, e permitirá a dissecação dos mecanismos chave de pormenor que regem a inserção de proteínas de membrana diferentes (receptores, canais de iões, transportadores, etc) para da PM.

Protocol

1. Preparando Cultura Glia Rato para o condicionamento de Cultura Neuronal

  1. Frascos T75 são revestidos com uma solução de colagénio (1:3 diluição de Purecol em DDH 2 O). Os frascos são erguidas e deixa-se secar durante a noite numa câmara de cultura de tecidos.
  2. Tampão dissecção (aCSF: 119 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1 mM de MgCl2, 30 mM de glicose, 25 mM de HEPES, pH 7,4, sem cálcio) e os meios da glia (DMEM suplementado com 10% de FBS, 10 unidades / ml de penicilina, 10 ug / ml de estreptomicina, e Glutamax) são preparadas e armazenadas a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
  3. No dia da cultura as células gliais, os meios de comunicação glia é aquecida durante pelo menos 30 min em banho de água a 37 ° C antes da dissecação de cérebros de ratos. Ratos embrionários ou neonatais são sacrificados por decapitação rápida. Córtex cerebral são dissecados sob um microscópio de dissecação.
  4. Tecidos cerebrais dissecados são digeridas em solução de papaína (100 ml de papaína e 20 ul de 1% de DNase I, em 2 ml de tampão de dissecção) a 37 ° C for 20 min.
  5. Após a digestão com papaína, tecidos cerebrais são lavados com 10 ml de meio pré-aquecido da glia. Media glia frescas (2 ml) é então adicionado aos tecidos cerebrais digeridos, e os tecidos são triturados com uma chapa de vidro polido ao fogo pipeta de Pasteur.
  6. Meios frescos glia (8 ml) é adicionado aos tecidos dissociados. A 70 uM de células-filtro é usado para filtrar a suspensão de tecido dissociado. As células são então semeadas em frascos T75 (geralmente 2-3 embriões pode semear um frasco T75), e colocados em um de 37 ° C célula incubadora de cultura.
  7. No dia seguinte, os meios de comunicação a partir dos frascos T75 é aspirado. Os balões são lavados com 10 ml de PBS. Media glia frescos (10-15 ml) é então adicionado a cada frasco.
  8. Dentro de 10-12 dias, as células gliais nos frascos T75 deve ser confluente. As células gliais são lavadas com PBS, e de 5 ml de tripsina a 0,05% é adicionado a cada frasco T75.
  9. Após incubação com tripsina a 37 ° C durante 5 minutos, as células gliais são células dissociadas e glial de cada frasco T75 são divididos em doisdiferentes de colagénio revestidos frascos T75.
  10. Inserções de cultura (Millipore PICM03050) são preparados colocando-as em placas de 6 poços, revestindo-os com o colagénio, e o ar de secagem durante a noite. Media glia (2 ml cada) é colocado por baixo de cada inserção de cultura.
  11. Glia de frascos T75 confluentes são tripsinizadas e semeadas sobre as inserções de cultura (de um frasco T75 por placa de 6 poços, 2 ml cada inserção). Estas inserções de cultura glia será utilizada para condicionar as culturas neuronais.

2. Cultura neuronal

  1. As lamelas de vidro para cultura neuronal são limpos por imersão em 70% HNO 3, pelo menos durante a noite. As lamelas são em seguida lavadas com DDQ 2 O, pelo menos, 3 vezes, e secou-se num forno Isotemp (> 200 ° C) durante a noite.
  2. Lamelas limpos são colocados numa placa de 6 poços, uma lamela por poço. As lamelas são revestidas com poli-L-Lisina a solução (2 ml, 0,1% em 100 mM de ácido bórico, pH = 8,5) durante a noite numa incubadora a 37 ° C.
  3. Opoli-L-lisina solução é removida e as lamelas lamelas foram lavadas 3 vezes com autoclavado DDH 2 O. As lamelas são em seguida incubadas numa incubadora a 37 ° C durante a noite em meio de plaqueamento (Neurobasal suplementado com soro de cavalo a 5% inactivado pelo calor, a 10 unidades / ml de penicilina, estreptomicina 10 ug / ml, Glutamax, 2% B27 suplemento é adicionado ao meio de plaqueamento no dia em que é usado).
  4. No dia seguinte, o meio de revestimento é removida e 2 ml de meio fresco com chapeamento B-27 é adicionada a cada poço que tem uma lamela de vidro.
  5. Ratas grávidas (E15-18) são sacrificados com CO 2, e os ratos embrionárias são sacrificados por decapitação. O hipocampo ou estriado é dissecado a partir do tecido cerebral e colocados em um tubo de 15 ml com tampão arrefecido com gelo de dissecação, para a cultura de neurónios do hipocampo ou do estriado neurónios espinhosos médios, respectivamente.
  6. Tecidos cerebrais dissecados são dissociados com papaína, tal como descrito nas etapas 1.4) e 1.5).
  7. Fepois de dissociação, o número de células em cada suspensão neuronal é contado com um hemocitómetro. Os neurónios são então semeadas em cada lamela, a uma densidade de 0,4 x 10 6 células por poço de uma placa de 6 poços, e cultivadas numa incubadora a 37 ° C durante a noite (neurónios são DIV 0).
  8. Para preparar inserções de cultura condicionado por células gliais as culturas neuronais, os meios de comunicação glia é removido das inserções de cultura de células da glia e meio de revestimento fresco é adicionado (2 ml na inserção e 2 ml por baixo da inserção).
  9. No dia seguinte (DIV 1), com lamelas de neurónios são colocadas por baixo das inserções de cultura da glia, um lamínulas em cada poço.
  10. Os neurónios são alimentados com metade do volume de meio fresco pré-aquecido com alimentação (B-27) a cada 3-4 dias até que estejam prontos para experiências de transfecção e de imagem.

3. Transfecção

  1. Neuronal transfecção é realizada utilizando Lipofectamine 2000. Para cada cultura neuronal (uma cultura por cada lamela), 2 ulLipofectamine 2000 e 1 ug de ADN são utilizados. Meio Neurobasal fresco, sem suplemento é usado para diluir a Lipofectamina e DNA.
  2. DNA Lipofectamine e são incubadas durante 20 min à temperatura ambiente após a mistura.
  3. Salve 1 ml dos meios de comunicação de baixo cada inserção da cultura glia, e 1 ml de dentro de cada inserção, e transferir a mídia para um tubo cônico. Adicionar o mesmo volume de meio de alimentação + B27 para o meio de salva, e incubar a 37 ° C. Este meio é utilizado para a cultura neuronal após transfecção.
  4. Seguindo a incubação de 20 min Lipofectamine / DNA, as inserções de cultura são removidas da glia momentaneamente a partir das placas de 6 poços. A mistura de Lipofectamine 200 / ul de ADN é adicionado a cada lamela com neurónios. As inserções de cultura de células gliais são então devolvidos a cada poço, acima dos neurónios. Geração de bolhas sob a membrana das inserções de cultura deve ser evitado. Os neurónios são incubadas com a mistura de Lipofectamine / DNA a 37 ° C durante 2-4 hr.
  5. Depois ªe 2-4 hr período de incubação, as inserções são removidas novamente da glia. Os meios de cultura com a mistura de Lipofectamine / DNA é removida de cada poço. Os meios de comunicação guardados no passo 3.3) é adicionada a neurónios (2 ml por poço). Inserções de cultura glia são devolvidos a cada poço, e os meios de comunicação glia de cada inserção é removido, e 2 ml de meios de comunicação a partir do passo 3.3) é adicionado em cada pastilha.
  6. Os neurónios são cultivados durante uma hora adicional a 24-72 permitir a expressão de ADNc transfectado antes TIRF imagem é executada no estes neurónios.

4. TIRF imagem

  1. Fluido cerebrospinal artificial (aCSF: 119 mM de NaCl, 2,5 mM KCl, 30 mM de glicose, 2 mM de CaCl2, 1 mM de MgCl2, 25 mM de HEPES, pH = 7,4) será utilizado para geração de imagens ao vivo experimentos. Nosso sistema de imagem TIRF é costume set-up com um 100-mW Ciano laser para excitação, e uma carga do elétron Multiplicando Juntamente câmera do dispositivo (EMCCD) para um detector.
  2. Antes de experimentos com imagens, o aCSF é advertido em um 37 & dpor exemplo, C banho de água durante pelo menos 30 min. O inserto para geração de imagens ao vivo de aquecimento é colocada na platina do microscópio, e a inserção de aquecimento, laser, câmara e são aquecidos durante pelo menos 30 minutos antes do início das experiências de imagiologia.
  3. A lamela com os neurônios transfectadas é montado na câmara ao vivo de imagens. O aCSF pré-aquecido é colocado na câmara depois da câmara é montada, esta etapa deve ser completado tão rapidamente quanto possível.
  4. Uma vez que a câmara é colocada sobre o inserto de aquecimento sobre a platina do microscópio, os neurónios transfectadas são identificadas visualmente sob epi-fluorescente modo de imagem.
  5. Após saudáveis ​​neurônios transfectadas são identificadas (ver as Figuras 1 e 2), que normalmente executam 1 ​​min de foto-branqueamento para eliminar preexistente pHluorin fluorescência na membrana plasmática, tal como pHluorin-receptores na membrana plasma ter níveis muito elevados de fluorescência quando TIRF imagem é iniciado, o que interfere com a visualização de ins indivíduoertion eventos.
  6. Seguindo Fotobranqueador, o ajuste de ganho do multiplicador de electrões na câmara EMCCD é ajustado para o máximo, e a gravação é realizada durante 1 min a 10 Hz.
  7. Cada gravação irá conter 600 imagens. Eventos de inserção individuais são identificadas por jogar nas costas de gravação usando ImageJ. Eventos de inserção individuais são analisados ​​manualmente usando ImageJ.

5. Resultados representativos

Cultura neuronal consistente é a chave para o sucesso de imagem ao vivo experimentos. Figura 1 mostra os neurônios do hipocampo de rato cultivadas utilizando nosso protocolo de DIV DIV 11 a 18. É claro a partir das imagens que os neurônios se desenvolveram processos extensos e que os processos dendríticas são cobertos densamente com espinhas dendríticas, indicações de que esses neurônios são saudáveis ​​na cultura. O protocolo de cultura pode também ser utilizado para outros tipos de neurónios no cérebro. Por exemplo, recentemente utilizado este protocolo para culturaestriado neurônios espinhosos médios em um estudo para examinar receptor de dopamina D2 (DRD2) inserção na cultura de neurônios de rato médio estriado espinhosas. 9 Figura 2 mostra rato estriado neurônios espinhosos médios cultivadas utilizando nosso protocolo em DIV 8. Temos também realizada com sucesso TIRF imagiologia de superecliptic DRD2s pHluorin-tagged neste tipo de neurónio. Figura 3 mostra a expressão de pHluorin-tagged DRD2 (pH-DRD2) num neurónio spiny médio e visualização de pH-DRD2 inserção neste neurónio.

Figura 1
Figura 1. Cultura do hipocampo do rato pelo método de cultura de interface. DIV: dias in vitro, o dia de cultura é considerada como DIV 0. A partir das imagens, é evidente que os neurónios do hipocampo maduros neste tipo de cultura entre 11 e DIV DIV 15. Às 11 e 13 DIV, dendrites neuronais são cobertas com espinhas filipodia e imaturas. Às 15 e DIV18, dendritos neuronais são cobertos com espinhos grandes, uma indicação de mais neurônios maduros. Painéis esquerdo: ampliação de imagens de baixa de neurônios do hipocampo de rato em diferentes idades. Painéis direito: ampliação de imagens de alta (zoom em dendritos neuronais do painel esquerdo) de processos neuronais dendríticas com espinhas dendríticas em diferentes idades.

Figura 2
Figura 2. Rato estriatal média spiny cultura neuronal utilizando o método de cultura de interface. Neurônios nas imagens estão em DIV 8.

Figura 3
Figura 3. Um rato estriatal meio neurônio espinhoso transfectadas com super eclíptica pHluorin-marcado receptor de dopamina D2 (pH-DRD2). Imagem à esquerda é a projeção de intensidade máxima de uma gravação de lapso de tempo (600 imagens, 100 ms por imagem). Setas brancas indicam a inserção vesicular individual de pH-DRD2. Esta imagem retém informação de inserção na dimensão xy, mas perde a informação da hora. Imagem da direita mostra a intensidade de projecção yt máximo, em que a pilha XYT é girada em 90 graus em torno do eixo y, e o pixel máximo em cada linha do eixo x é projectada para um pixel único eixo y. Esta imagem retém informação de inserção ao longo do eixo yt mas perde a informação eixo x.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Por razões desconhecidas, os neurônios de rato são sempre mais difíceis de cultura do que neurônios de rato. Em nossa experiência, uma cultura mista de neurônios e da glia funciona bem para os neurônios primários de rato cultivadas. No entanto, uma tal cultura mista não é adequado para as experiências de imagiologia TIRF, como neste tipo de cultura de neurónios e seus processos tendem a crescer em cima de células da glia, situando o somata neuronal e processos dendríticos para além do alcance de microscopia TIRF. Assim, uma cultura de baixa densidade neuronal com glia poucos na lamela é ideal para imagiologia TIRF. Testámos em primeiro lugar o método Banker 19, 20, em que o fundo de um prato de cultura é inoculado com as células gliais e neurónios são semeados sobre uma lamela e colocados de cabeça para baixo na placa de cultura. A lamela e a camada de células gliais são separados por três pequenas gotas de cera sobre a lamela. Este método funciona bem para a menor tamanho de lamelas (tais como lamelas de 15 mm ou de 18 mm), mas quando se testou a utilização de 25 mm-coverslips, neurónios, perto do centro das lamelas não eram tão saudáveis ​​como aquelas próximas das bordas lamela.

Embora a causa desta diferença de neurónio saúde não era claro para nós, fundamentado que pode ser devido à difusão limitada de nutrientes para o centro da área de lamela. Por isso, virou-se para o método de cultura de interface descrita neste manuscrito, como a membrana da inserção de cultura permite a difusão livre de nutrientes para os neurónios nas lamelas. Nós, os neurônios semeado em 25 mm lamelas, com os neurônios para cima. Nós glia semeadas em uma inserção de cultura, e colocado o alimentador glia inserção na parte superior da lamela. Determinou-se que o método de cultura de interface é superior a outros métodos já testados quando usando lamelas de 25 mm para cultura de baixa densidade neuronal do rato, e produz resultados consistentes para TIRF imagem. Para quantificar as propriedades de inserção receptor (frequência, amplitude), um grupo de controle com os neurônios transfectadas wom receptores tipo selvagem pHluorin com tag deve ser sempre incluído. Este grupo de controlo também serve como um controlo de qualidade para a cultura neuronal.

O nosso sistema de TIRFM é construído com base em um manual microscópio AxioObserver Zeiss (Carl Zeiss microfilmagem, Inc., Thornwood, NY). O laser de excitação é uma Newport-488nm 100mW Ciano Laser System (Newport Corporation, Irvine, CA). O laser é acoplado a uma barra deslizante TIRF Zeiss via uma fibra KineFLEX-P-2-S-488-640-0.7-FCP-P2 óptico (Fonte Point, Mitchell Point, Hamble, Reino Unido). A Z488RDC espelho dicróico (Chroma Technology Corporation, Bellows Falls, VT) foi usado para refletir o laser de entrada para um plano de Zeiss α-100X lente objetiva (NA = 1,46, Carl Zeiss). Um filtro de emissão de ET525/50 (Chroma Technology Corporation) foi utilizado para a detecção de fluorescência de GFP. Uma câmara Evolve EMCCD (Photometrics, Tucson, AZ), foi utilizado como o detector. Uma lente de relê 2.5X foi inserido entre a porta da câmara do microscópio e a câmaraera a fim de conseguir a resolução espacial óptima (0,064 mM por pixel quando usando o NA = 100X objetivo 1,46). A câmara foi mantida a -80 ° C durante as experiências de imagiologia. A Uniblitz LS6 obturador controlado por um controlador VMM-D3 (Vincent Associates, Rochester, NY) foi integrada entre a cabeça do laser e fibra de lançador. Os dados foram adquiridos utilizando μManager software ( http://www.micro manager.org / ).

Todas as experiências de imagiologia foram realizadas a 37 ° C em aCSF solução contendo 2 mM de CaCl 2. Esta solução aCSF é ajustado a pH = 7,4, à temperatura ambiente. Quando aquecida a 37 ° C, o pH torna-se deste aCSF 7,2, o que é óptimo para neurónios em cultura. Durante a aquisição, a energia laser é ajustado no máximo, tanto para o foto-branqueamento e para a aquisição de dados. Exposição da câmara foi fixada em 100 ms e taxa de aquisição foi de 10 imagens por segundo (10 Hz). Ganho EMCCD foi definido ummáximo t. As gravações foram analisadas usando software ImageJ (Rasband, WS, NIH, http://rsb.info.nih.gov/ij/ , 1997-2012), e eventos de inserção foram registrados e analisados ​​manualmente. Um total de eventos por minuto por unidade de superfície foram tomadas como a frequência de inserção, e foram normalizadas para o grupo de controlo como 100%. Yt imagens fundidas foram gerados em ImageJ rodando o original XYT pilha de 90 ° ao longo do eixo y, e a intensidade máxima de cada linha x foi projectado para um único pixel do eixo y usando o algoritmo de projecção de intensidade máxima em ImageJ.

Eventos de inserção são tipicamente observados como o aparecimento súbito de punta fluorescente (fase de subida rápida), seguida por uma fase de decomposição que representa receptor de difusão na membrana de plasma 7, 9. O aparecimento de fluorescência punta com uma fase lenta subida ou aquelas sem uma fase de decaimento aparente (disappe súbitaArance) estão excluídos da análise dos dados, uma vez que estes eventos representam, provavelmente, o tráfico de vesículas intracelulares que têm um lúmen menos ácidas (tais como aqueles a partir do retículo endoplasmático). Fotobranqueador de pré-existentes populações de receptores de superfície também vai minimizar a contribuição de agrupamento pré-existente no receptor de superfície da membrana plasmática. Até à data, todos os dados são analisados ​​manualmente usando ImageJ. Futuro desenvolvimento de algoritmos de computador para a detecção automática de eventos e análise de dados vai ser importante para facilitar a adaptação e aplicação do presente método de imagem para o exame de inserção do receptor para a membrana plasmática.

A fim de visualizar os eventos de inserção individuais vesiculares de pHluorin marcados receptores, vários parâmetros importantes têm de ser tomadas em consideração. Em primeiro lugar, a excitação do laser tem de ser forte o suficiente para permitir a detecção de fluorescência a partir de vesículas individuais. No nosso sistema de design personalizado, usamos um 10 0-mW laser de 488 nm, enquanto a fonte de excitação. Em segundo lugar, o detector do sistema de imagem deve ter tanto a sensibilidade e a velocidade de aquisição de dados em tempo real a partir de inserção do receptor, dinâmico. Por estas razões, nós usamos um EMCCD em nosso sistema. A combinação de um laser de excitação e um detector de forte EMCCD oferece capacidade de detecção de GFP única molécula no nosso sistema de geração de imagens. Nossa escolha de um sistema de TIRF de design personalizado é baseada na obtenção de máximo desempenho de limitados recursos disponíveis. Vale a pena notar que qualquer sistema, disponível comercialmente TIRF com potência suficiente laser de excitação (um 100-488-nm mW laser é suficiente para os nossos objectivos, e está prontamente disponível na maioria das plataformas comerciais) e uma câmara de EMCCD deve também ser adequado para imagiologia tais estudos. Portanto, a adaptação de tais estudos de imagem para os neurónios não é limitado pelo desempenho do sistema de TIRFM, mas a qualidade da cultura neuronal e consistência de culturas neuronais.

ove_content "> Em terceiro lugar, devido à fluorescência inicial de existir pHluorin-tagged receptores de membrana plasmática, Fotobranqueador sob o modo TIRF é tipicamente necessário para a detecção de fluorescência a partir de uma vesícula única. Nós realizar normalmente 1 minuto Fotobranqueador usando o modo de imagem TIRF no máximo potência do laser uma vez que um neurónio é identificada visualmente, o que resulta na eliminação da maioria da pré-existente de fluorescência de superfície pHluorin. Também é importante ter em mente que a energia de excitação do laser de alta também aumenta a possibilidade de danificação do laser e fototoxicidade. Na nossa experiência , usando um 100-488-mW mW laser como fonte de excitação não parece apresentar danos visíveis para os neurónios dentro do período de aquisição de dados, enquanto proporciona potência de laser suficiente para a visualização de receptores em vesículas individuais. Uma consideração adicional importante é a de que as diferenças na tipos e números de receptores em cada vesícula afectará também o requisito de excitação laser.Por exemplo, nós anteriormente foram capazes de examinar regulação de glutamato inserção subunidade do receptor GluA1 para a membrana do plasma utilizando uma excitação de 50 mW de laser 7. Nós estimamos que cada vesícula examinada neste estudo continha 56 ± 6 GluA1 moléculas, semelhante à estimativa feita por outro grupo utilizando métodos similares 12. No nosso estudo recente de DRD2, estimou-se que cada vesícula continha 30 ± 1 de moléculas, e um laser de 100 mW é suficiente para esse estudo. No entanto, devido ao elevado nível de ruído de fundo em células vivas, o exame de uma vesícula que contém apenas várias moléculas receptoras (por exemplo, 5-10) pode necessitar de uma maior potência de laser de 100 mW, a fim de atingir um nível suficiente de sinal-para- ruído para a visualização de inserção do receptor para a membrana plasmática em neurónios. Encontrar o equilíbrio de poder sensibilidade e excitação é importante para o planejamento de um estudo bem sucedido.

O uso de TIRFM que imago superecliptic receptores pHluorin-marcados foi aplicado a vários tipos diferentes de receptores neuronais 7-17. No entanto, é muito importante ter em mente que o nosso método actual se baseia em receptores de marcação com uma molécula de GFP e sobre-expressão de receptores marcados. Colocar uma molécula GFP para o domínio extracelular de uma proteína de membrana pode interferir com a função da proteína, e é, portanto, essencial para verificar que esta estratégia de marcação não interfere significativamente com a função da proteína em estudo 9. Além disso, um receptor sobre-expressa pode ser ou não ser sujeitos a mecanismos de regulação que governam o tráfico de receptores endógenos. Métodos independentes, são necessárias para validar os resultados obtidos a partir de imagens overexpressed pHluorin-marcadas receptores. Por exemplo, nos nossos estudos de GluA1 inserção 7, a expressão de superfície e de tráfico sináptica dos receptores endógenos GluA1 foram validados ucantar imunomarcação padrão / métodos bioquímicos ou abordagens eletrofisiológicas. Em resumo, a nossa abordagem de imagem, em combinação com outros métodos padrão para tráfico de proteína de membrana, é susceptível de ser um instrumento de dissecção detalhados mecanismos moleculares e celulares que regulam a inserção na membrana de plasma de outras proteínas da membrana em neurónios.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Não há conflitos de interesse declarados.

Acknowledgments

Este trabalho é apoiado por fundos de inicialização do Laboratório Jackson.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
purified bovine collagen solution (Purecol) Advanced Biomatrix 5005-B
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) GIBCO, by Life Technologies 14185-045
penicillin-streptomycin (Pen Strep) GIBCO, by Life Technologies 15140-122
sodium pyruvate GIBCO, by Life Technologies 11360-070
DMEM High Glucose GIBCO, by Life Technologies 10313-021
fetal bovine serum (FBS)
GlutaMAX GIBCO, by Life Technologies 35050-061
papain Worthington Biochemical Corp. LS003126
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (DNase I) Sigma-Aldrich DN25-10MG
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) GIBCO, by Life Technologies 14190-144
0.05% trypsin GIBCO, by Life Technologies 25300-054
poly-l-lysine hydrobromide Sigma-Aldrich P2636-1G
boric acid Fisher Scientific BP 168-500
Neurobasal Medium GIBCO, by Life Technologies 21103-049
B-27 Serum-Free Supplement GIBCO, by Life Technologies 17504-044
heat inactive horse serum GIBCO, by Life Technologies 26050-070
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668 019
HEPES Fisher Scientific BP310-500
Culture Insert EMD Millipore PICM03050

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, G. M., Hayashi, T., Chiu, S. L., Chen, C. M., Huganir, R. L. Palmitoylation by DHHC5/8 targets GRIP1 to dendritic endosomes to regulate AMPA-R trafficking. Neuron. 73, 482-496 (2012).
  2. Anggono, V., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor trafficking and synaptic. Curr. Opin. Neurobiol. , (2012).
  3. Makuch, L., Volk, L., Anggono, V., Johnson, R. C., Yu, Y., Duning, K., Kremerskothen, J., Xia, J., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor function by the human memory-associated gene KIBRA. Neuron. 71, 1022-1029 (2011).
  4. Thomas, G. M., Lin, D. T., Nuriya, M., Huganir, R. L. Rapid and bi-directional regulation of AMPA receptor phosphorylation and trafficking by JNK. EMBO J. 27, 361-372 (2008).
  5. Lin, D. T., Huganir, R. L. PICK1 and phosphorylation of the glutamate receptor 2 (GluR2) AMPA receptor subunit regulates GluR2 recycling after NMDA receptor-induced internalization. J. Neurosci. 27, 13903-13908 (2007).
  6. Hayashi, T., Rumbaugh, G., Huganir, R. L. Differential regulation of AMPA receptor subunit trafficking by palmitoylation of two distinct sites. Neuron. 47, 709-723 (2005).
  7. Lin, D. T., Makino, Y., Sharma, K., Hayashi, T., Neve, R., Takamiya, K., Huganir, R. L. Regulation of AMPA receptor extrasynaptic insertion by 4.1N, phosphorylation. 12, 879-887 (2009).
  8. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 11080-11085 (2010).
  9. Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Zhang, L. F., Sampson, S. B., Yang, Y. P., Lin, D. T. Identification of Two Functionally Distinct Endosomal Recycling Pathways for Dopamine D2 Receptor. Journal of Neuroscience. , (2012).
  10. Yu, Y. J., Dhavan, R., Chevalier, M. W., Yudowski, G. A., von Zastrow, M. Rapid delivery of internalized signaling receptors to the somatodendritic surface by sequence-specific local insertion. J. Neurosci. 30, 11703-11714 (2010).
  11. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., von Zastrow, M. Distinct modes of regulated receptor insertion to the somatodendritic plasma membrane. Nat. Neurosci. 9, 622-627 (2006).
  12. Yudowski, G. A., Puthenveedu, M. A., Leonoudakis, D., Panicker, S., Thorn, K. S., Beattie, E. C., von Zastrow, M. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J. Neurosci. 27, 11112-11121 (2007).
  13. Ashby, M. C., De La Rue, S. A., Ralph, G. S., Uney, J., Collingridge, G. L., Henley, J. M. Removal of AMPA receptors (AMPARs) from synapses is preceded by transient endocytosis of extrasynaptic AMPARs. J. Neurosci. 24 (AMPARs), 5172-5176 (2004).
  14. Kopec, C. D., Real, E., Kessels, H. W., Malinow, R. GluR1 links structural and functional plasticity at excitatory synapses. J. Neurosci. 27, 13706-13718 (2007).
  15. Makino, H., Malinow, R. AMPA receptor incorporation into synapses during LTP: the role of lateral movement and exocytosis. Neuron. 64, 381-390 (2009).
  16. Makino, H., Malinow, R. Compartmentalized versus global synaptic plasticity on dendrites controlled by experience. Neuron. 72, 1001-1011 (2011).
  17. Wang, Z., Edwards, J. G., Riley, N., Provance, D. W., Karcher, R., Li, X. D., Davison, I. G., Ikebe, M., Mercer, J. A., Kauer, J. A., Ehlers, M. D. Myosin Vb mobilizes recycling endosomes and AMPA receptors for postsynaptic plasticity. Cell. 135, 535-548 (2008).
  18. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394, 192-195 (1998).
  19. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat. Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
  20. Sekine-Aizawa, Y., Huganir, R. L. Imaging of receptor trafficking by using alpha-bungarotoxin-binding-site-tagged receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17114-17119 (2004).

Tags

Neurociência Edição 69 Biologia Celular Bioengenharia Medicina neurônio principal do mouse culta pHluorin superecliptic receptor plasma inserção membrana microscopia de fluorescência de reflexão interna total os neurônios ratos pHlourin-marcado membrana plasmática
Imagiologia pHluorin-tagged Inserção receptor para a membrana plasmática em primários de rato cultivadas Neurons
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, … More

Li, Y., Roy, B. D., Wang, W., Zhang, L., Sampson, S. B., Lin, D. T. Imaging pHluorin-tagged Receptor Insertion to the Plasma Membrane in Primary Cultured Mouse Neurons. J. Vis. Exp. (69), e4450, doi:10.3791/4450 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter