Enkla och reproducerbara förfaranden beskrivs för att göra tre strukturellt distinkta kollagen församlingar från en gemensam kommersiellt tillgänglig typ I kollagen-monomer. Native typ kan fibrösa långa avstånd eller segmentell lång avstånd kollagen konstrueras genom att variera de förhållanden som de 300 nm lång och 1,4 nm i diameter monomer byggsten är utsatt för.
Kollagenfibriller är närvarande i den extracellulära matrisen av djurvävnad för att tillhandahålla strukturell byggnadsställningar och mekanisk hållfasthet. Dessa nativa kollagenfibriller har en karakteristisk banding periodicitet ~ 67 nm och är bildade in vivo genom den hierarkiska montering av typ I-kollagen monomerer, som är 300 nm i längd och 1,4 nm i diameter. In vitro, genom att variera de förhållanden som monomer byggstenar utsätts, kan unika strukturer varierar i längdskalor upp till 50 mikrometer byggas, bland annat inte bara naturliga typ fibriller, men också fibrös lång avstånd och segmentell långa avstånd kollagen. Häri presenterar vi rutiner för att bilda tre olika kollagen strukturer från en gemensam kommersiellt tillgänglig kollagen monomer. Via de protokoll som vi och andra har publicerat tidigare för att göra dessa tre typer normalt leda till blandningar av strukturer. I synnerhet var unbanded fibriller vanligt found när du gör nativt kollagen och infödda fibriller var ofta närvarande när du gör fibrösa lång avstånd kollagen. Dessa nya förfaranden har fördelen att producera den önskade kollagen fibrill typ nästan uteslutande. Bildningen av de önskade strukturerna verifieras genom avbildning med ett atomkraftsmikroskop.
Kollagen är en klass av strukturella proteiner som har en trippel spiralformad struktur bildad av tre polypeptidkedjor. Dessa trippelhelix monomerer samlas ytterligare i en hierarkisk sätt för att bilda gradvis större strukturer. Det finns minst 28 genetiskt olika kollagen typer som har identifierats 1. Tillsammans kollagener utgör 30% av det totala protein som finns i djur, med typ I den vanligaste formen står för upp till 90% av alla kollagenproteiner 2. Typ I-kollagen återfinns som fibrillous strukturer i hud, ligament, senor och ben. Atomkraftsmikroskop (AFM) och elektronmikroskop (EM) bilder av typ I nativa kollagenfibrer typiskt visar bandning med en karakteristisk tid på ~ 67 nm (ofta kallad D-banding) 3-5.
Typ I kollagen-monomer är en trippelhelix heterotrimer bestående av två identiska α1 (I)-kedjor och en α2 (I)-kedjan, var mer än entusen aminosyror långa. Det är lång och tunn med måtten 300 nm i längd och 1,4 nm i diameter. Typ I kollagen-monomer kan lätt erhållas genom att bryta ner naturligt bildade högre ordningens strukturer 6. Vi 7 och många andra 8-10 har visat att dessa lösliga monomer byggstenar kan sedan användas för att rekonstruera D-bandade fibriller in vitro (Figur 1).
Förutom nativa kollagenfibriller, har två andra högre ordningens kollagen strukturer befunnits bildas in vitro med användning av samma block monomeren byggnad. De två strukturerna är fibrösa långa avstånd (FLS) och segmentell lång avstånd (SLS) kollagen (figur 1). FLS kollagen är en fibrillous konstruktion som nativt kollagen, men kännetecknas av en större banding periodicitet än nativt kollagen 11. In vitro bildar FLS kollagen när kollagen monomeren kombineras med α1-syraglykoprotein <sup> 12. FLS kollagen har observerats in vivo också, men sällan 13. SLS kollagen beskrivs som kristalliter eftersom monomererna är inriktade i registret som i ett kristallgitter 14. SLS kollagen bildas när kollagen monomeren kombineras med adenosintrifosfat (ATP) 15. Naturligt förekommande SLS kollagen har observerats i odlingsmediet av fibroblaster men inte i extraherade vävnadsprover, sannolikt på grund av sin ringa storlek och brist på urskiljbara topografiska särdrag 16.
Målet med detta manuskript är att presentera detaljerade förfaranden för att göra infödda kollagenfibriller samt FLS och SLS kollagen som även den mest oerfarne forskaren kan återge. Använda kommersiellt tillgängliga avancerade utgångsmaterial har vi försökt att göra protokollen så enkelt som möjligt och ändå få dem fungera tillförlitligt. Vi detalj också hur man använder en AFM att karakterisera de olika kollagen strukturs som görs. Detta arbete kommer att vara till nytta för forskare som vill studera en eller flera av dessa högre strukturer ordning kollagen och / eller använda dem som prekursorer i andra program, men för närvarande brist på kompetens eller helt enkelt inte vill arbeta med vävnadsprover.
Renat kollagen monomeren är stabilt vid lågt pH och temperatur och bildandet av nativa kollagenfibriller huvudsakligen innebär höjning av pH och temperatur av kollagen monomerlösningen. Förfaranden för beredning av bandad kollagenfibriller från monomerer har funnits i mer än 50 år. Det förfarande som vårt laboratorium som används i våra första studier med kollagen 15 år sedan 7 byggde på förfaranden sammanfattas av Chapman och medarbetare i 1986 10. Villkoren för kollagen fibrillbildning i det tidigare arbetet var 0,18 mg / ml kollagen monomer i Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) buffert vid 34 ° C. Nackdelen med denna och andra förfaranden som vi har försökt är att det alltid unbanded fibriller bildas vid sidan av de önskade bandad fibriller. Våra nya förhållanden är ~ 0,3 mg / ml kollagen monomer i 100 mM fosfat och 100 mM KCl vid pH 7 stå vid 37 ° C under 3-4 timmar. De förfarandenrande som beskrivs här skiljer sig i varje aspekt från den tidigare förfarandet för infödda kollagenfibriller. Men mest märkbart, har vi fördubblat jonstyrkan genom att höja buffertkoncentrationen och tillsätta 100 mM KCl. Ökningen i jonstyrka resulterar i mer enhetlig bildning av uteslutande bandad kollagenfibriller.
Enligt vår erfarenhet var de enda gånger att detta förfarande inte har producerats naturligt typ kollagen när kollagen monomerlösning var förbi tillverkarens rekommenderade datum för användning. När detta inträffar, vad observeras varierar från mindre fibriller som alla är unbanded många fibriller fortfarande observerade men huvudsakligen unbanded. Observera att utgånget kollagen monomer fortfarande ofta med framgång kan användas för att göra nativt kollagen, men när det misslyckas, bör nytt kollagen monomer definitivt köpas.
FLS identifierades först av Highberger et al. Krediteras Orekhovic 17 i kollagen preparatH et al. 18. Ytterligare studier ledde Highberger och Schmitt att dra slutsatsen att det var α1-glykoprotein som främjar bildandet av FLS 12. Vi kunde sedan kan replikera förfarandet för FLS kollagen genom att kombinera kommersiellt tillgänglig kollagen monomer och α1-syra glykoprotein vid lågt pH och långsamt låta pH stiga genom dialys blandningen mot vatten under 24 timmar 11. Vi presenterar nu en modifiering av detta förfarande genom dialys kollagen monomeren mot vatten först och bara kombinera det med α1-syra glykoprotein i vatten för att bilda FLS kollagen. Villkoren för FLS kollagen montering beskrivs här är mycket mindre tidskrävande. Kollagen monomeren behöver fortfarande vara pre-dialyserades mot vatten, men det kan göras i bulk och lagrades sedan vid 4 ° C stabilt tills den används. Detta nya förfarande ger FLS huvudsakligen bandad kollagenfibriller.
Från vår erfarenhet, α1-syra Glycoprotein med en lägre sammanlagd protein och vattenhalt, och genom slutledning högre sockerhalt, är avgörande för att framgångsrikt göra FLS fibriller. Vi kontrollerar vanligen med tillverkaren att den α1-syra glykoprotein mycket vi använder har en kombinerad% protein och vattenhalt 82 eller mindre. Och som med förfarandet för nativt kollagen syntes, kollagen monomer som är för gammal kan också resultera i att man inte producera FLS kollagen. Dessutom, är renheten hos det vatten som används för dialysen kritiska i detta förfarande. Till exempel, dialys av kollagen-monomer även mot ~ 8 MΩ.cm stället> 18 MΩ.cm resulterar vatten i en kollagenlösning som inte kommer att bilda FLS kollagen.
Av de tre kollagen fibril typer är det enklaste att göra SLS kollagen. Den tidigaste beredningen av SLS beskrevs av Schmitt och medarbetare 15. Vi publicerade en anpassning av detta förfarande 12 år sedan för att göra SLS kollagen med kommersiellt tillgängliga Collagen 14. Förfarandet innebar att helt enkelt kombinera 2 mg / ml ATP och 0,5 mg / ml kollagen monomer i 0,05% (volym / volym) ättiksyra vid pH 3,5, och lämnar blandningen vid rumstemperatur över natten.
I vår erfarenhet, är den kritiska aspekten av SLS aggregat som måste styras pH hos reaktionslösningen. SLS monteras i mer grundläggande förhållanden (~ pH 3,6-3,9) resulterar i aggregerade klumpar kristalliter. Surare förhållanden (~ pH 2,9-3,2) resulterar i tunnare, mer avskilda kristalliter än de samlade under ideala förhållanden med pH 3,3-3,5. Reaktion pH utanför detta intervall (<2,8 och> 4) inte ger någon SLS kollagen. I det förflutna, inställdes vi pH för reaktionsblandningen genom tillsats av ättiksyra. För att förenkla förfarandet ytterligare, i detta manuskript introducerade vi en glycin-HCl-buffert för att kontrollera pH.
De tre olika kollagen strukturer bildade från protokollen beskrivna ovan har karaktärrealistisk funktioner som bara kan urskiljas genom instrument som kan nanometer upplösning. Infödda och FLS kollagen kännetecknas av band periodicitet av ~ 67 nm och ~ 270 nm. Den längsta dimensionen av SLS kollagen är bara ~ 360 nm. Vi har beskrivit specifikt hur vi använder en AFM att karakterisera tre olika kollagen strukturer. Dock bör alla AFM verkar i kontakt eller intermittent kontakt läge med någon AFM sond med <10 nm radie också kunna bild dessa kollagen strukturer. Dessutom, kan elektronmikroskopi vara och har använts för att karaktärisera dessa kollagen strukturer 19.
Den stora fördelen med dessa förfaranden är att de producerar huvudsakligen den önskade kollagenkonstruktionen. Den enda andra formen av kollagen som finns i dessa reaktioner är utgångsmonomeren, som ofta syns i bakgrunden av AFM-bilder. I fallet med nativt och FLS kollagen, kan de lätt separeras från det mesta av orealicted monomeren genom upprepad centrifugering och tvättning av den resulterande nativt eller FLS kollagen pelleten med vatten.
Vi har presenterat enkla och tillförlitliga förfaranden för att göra infödda, FLS och SLS kollagen med hjälp av avancerade, kommersiellt tillgängliga utgångsmaterial. Kollagenet monomeren som används i alla dessa förfaranden är kommersiellt tillgänglig i en renad form. α1-glykoprotein och ATP är också båda kommersiellt tillgängliga.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka alla de många tidigare grundutbildning, forskarutbildning och postdoktorala studenter som har bidragit sin tid och ansträngningar på att studera kollagen fibrogenes i vårt laboratorium. Den naturvetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada har kontinuerligt finansierat våra kollagen studier.
Material/reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
mica | Ted Pella | 53 | |
Pointprobe – Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |