기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에
Summary
간편하고 재현 절차는 일반적인 상업적으로 이용 가능한 유형 I 콜라겐 모노머에서 세 구조적으로 구분 콜라겐 어셈블리를 만들기위한 설명되어 있습니다. 기본 유형은 섬유 긴 간격 또는 segmental 긴 간격 콜라겐은 300 nm의 긴 1.4 나노 미터 직경 단량체 빌딩 블록이 노출되는에 조건을 변화하여 구성 할 수 있습니다.
Abstract
콜라겐 원 섬유는 구조 비계와 기계적 강도를 제공하기 위해 동물 조직의 세포 외 기질에 존재한다. 이러한 기본 콜라겐 원 섬유는 ~ 67 nm의 특성 구간 주기성을 가지고 길이와 직경 1.4 나노 미터에 300 nm의 아르 유형 I 콜라겐 단량체의 계층 총회를 통하여 생체에 형성된다. 체외에서, 그에게 조건을 변화하여 단량체 빌딩 블록이 노출되어, 50 미크론까지의 길이 저울에 이르기까지 독특한 구조는 기본 타입 원 섬유뿐만 아니라 포함 건설뿐만 아니라, 섬유 긴 간격 및 segmental 긴 간격 콜라겐. 할 수 있습니다 여기, 우리는 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 콜라겐 모노머의 세 가지 콜라겐 구조를 형성하기위한 절차를 제시한다. 우리와 다른 사람들이 세 가지 유형의를 만들기 위해 과거에 출판 한 프로토콜을 사용하는 것은 일반적으로 구조의 혼합물로 연결됩니다. 특히, unbanded 원 섬유는 일반적으로 F했다기본 콜라겐을 만들 때 ound, 그리고 섬유 긴 간격 콜라겐을 만들 때 기본 원 섬유는 종종 참석했다. 이 새로운 절차는 거의 대부분 원하는 콜라겐 섬유 종류를 생산의 장점이 있습니다. 원하는 구조의 형성은 원자 힘 현미경을 사용하여 영상으로 확인됩니다.
Introduction
콜라겐은 세 폴리펩티드 사슬에서 형성 트리플 나선형 구조를 가지고 구조 단백질의 클래스입니다. 이 트리플 나선형 단량체은 또한 점점 더 큰 구조를 형성 할 수있는 hierarchal 방식으로 조립. 1 확인되었습니다 최소 28 유전자 다른 콜라겐 종류가 있습니다. 결합, 콜라겐으로 합성 한 모든 콜라겐 단백질 2 90 %까지 I 지배적 인 양식 회계를 입력과 동물에서 발견 된 총 단백질의 30 %를 차지합니다. 입력 I의 콜라겐은 피부, 인대, 힘줄과 뼈에 fibrillous 구조로 발견됩니다. 원자 힘 현미경 (AFM)과 전자 현미경 (EM) I 기본 콜라겐 섬유는 일반적으로 ~ 67 nm의 3-5 (보통 D-구간로 칭함)의 특징 기간과 구간 표시 형식의 이미지.
제가 콜라겐 모노머는 두 개의 동일한 α1 (I) 체인 하나 α2 (I) 체인보다 각각 더로 구성된 트리플 나선형 heterotrimer입니다 입력긴 천 아미노산. 그것은 긴 길이와 직경 1.4 나노 미터에 300 nm의 크기와 얇은입니다. 콜라겐 단량체가 쉽게 자연적으로 형성된 높은 순서 구조에게 6 파괴함으로써 얻을 수 I를 입력합니다. 우리 7 많은 사람들의 8-10는 이러한 수용성 단량체 빌딩 블록은 다음 체외에서 D-밴드 원 섬유를 (그림 1) 재구성하는 데 사용할 수있는 것으로 나타났습니다.
기본 콜라겐 원 섬유뿐만 아니라, 두 개의 다른 높은 순서 콜라겐 구조는 같은 단량체 빌딩 블록을 사용하여 체외에서 형성하는 것으로되어 있습니다. 두 구조는 섬유 긴 간격 (FLS) 및 segmental 긴 간격 (SLS) 콜라겐 (그림 1)입니다. 콜라겐 모노머은 α1-산성 당 단백질과 결합 될 때 FLS 콜라겐은 원래 콜라겐 같은 fibrillous 구조이지만, 원래 콜라겐 11. 체외에서보다 큰 구간 주기성을 특징으로하는, FLS의 콜라겐이 형성 <suP> 12. FLS의 콜라겐은 비록 거의 13도 생체에서 관찰되지 않았습니다. 단량체가 결정 격자 14처럼 레지스터에 정렬되어 있기 때문에 SLS의 콜라겐이 crystallites으로 설명되어 있습니다. 콜라겐 모노머는 아데노신 삼인산 (ATP) 15와 결합 될 때 SLS의 콜라겐이 형성한다. 자연적으로 발생 SLS의 콜라겐은 섬유 아세포의 문화 매체에서 관찰되지만 추출 조직 샘플에서 가능성이 작은 크기와 구별 지형은 16 부족으로 인해.되었습니다
이 원고의 목표는 잘 FLS, 심지어 가장 경험이 연구자가 재현 할 수있는 SLS의 콜라겐과 같은 기본 콜라겐 원 섬유를 만들기에 대한 자세한 절차를 제시하는 것입니다. 상업적으로 이용 가능한 고급 출발 물질을 사용하여, 우리는 가능한 한 간단하게 프로토콜을 만들기 위해 노력하고 아직도 그들을 안정적으로 작동하고 있습니다. 어떻게 다른 콜라겐 구조를 특성화 AFM을 사용하는 방법 또한 자세히만든 s입니다. 이 작품이 높은 순서 콜라겐 구조 중 하나 이상을 공부 및 / 또는 기타 응용 프로그램에서 전구체로 사용하려면 연구자에게 도움이 될하지만, 현재 전문 지식의 부족하거나 조직 샘플에서 작동하도록하지 않으 않습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
콜라겐 단량체를 정화하는 것은 낮은 산도와 온도에 안정적이며, 기본 콜라겐 원 섬유의 형성은 기본적으로 콜라겐 모노머 솔루션의 pH 및 온도를 높여 포함됩니다. 단량체의 밴드 콜라겐 원 섬유의 reconstitution에 대한 절차는 50 년 이상 동안 존재했습니다. 15 년 전 콜라겐과 첫 번째 연구에 사용 된 저희 연구실은 7 절차에 따라되었음을 절차는 1986 10 채프만과 동료에 의해 요약. 그 이전 일에 콜라겐 섬유 형성을위한 조건은 34에서 오세영이 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0.2, 산도 7.4) 버퍼에 0.18 MG / 콜라겐 모노머의 ML ° C. 있었다 이것과 우리가 노력 한 다른 절차의 단점은 원하는 밴드 원 섬유와 함께 형성 항상 unbanded 원 섬유가 있다는 것입니다. 새로운 조건 ~ 산도 7 100 MM 인산과 100 밀리미터 KCl의 0.3 MG / 콜라겐 모노머의 ML 3-4 시간에 37 ° C에서 떠났다.에게 procedure는 기본 콜라겐 원 섬유를 만들기 위해 이전 절차에서 모든면에서 차이가 여기에 설명했다. 하지만 대부분의 현저하게, 우리는 버퍼 농도를 높여 100 밀리미터 KCl을 추가하여 이온 강도를 두 배로했습니다. 독점적 밴드 콜라겐 원 섬유의 더 일관성 형성에 이온 강도 결과에 증가하고 있습니다.
콜라겐 모노머 솔루션은 사용 제조업체의 권장 기간을 통과했을 때 우리의 경험에서이 절차는 기본 유형 콜라겐을 생산하지 않은 유일한 시간이었다. 이 문제가 발생하면, 어떻게 모든 여전히 관찰 많은 원 섬유에 unbanded하지만 주로 unbanded 아르 이하의 원 섬유의 범위를 관찰합니다. 유효 기간이 만료 콜라겐 모노머은 종종 여전히 기본 콜라겐를 만들기 위해 사용할 수 있지만, 실패 할 경우, 새로운 콜라겐 모노머은 분명히 구입해야합니다.
FLS 먼저 Highberger 외에 의해 확인되었다. 콜라겐 준비에 17 Orekhovic에 반영H 외. 18. 또한 연구 Highberger와 슈미트는이 FLS (12)의 형성을 촉진 α1-산성 당 단백질이라고 빠졌다는 생각이 들어서. 우리는 나중에 상업적으로 이용 가능한 콜라겐 모노머과 낮은 산도에서 α1-산성 당 단백질을 결합 천천히 산도는 24 시간 11 물에 대한 혼합물을 dialyzing으로 증가 할 수 있으므로 FLS의 콜라겐을위한 절차를 복제 할 수있었습니다. 우리는 지금 첫번째 물에 대한 콜라겐 모노머를 dialyzing하고 간단하게 FLS의 콜라겐을 형성하기 위해 물에 α1-산성 당 단백질과 결합하여 그 절차의 수정을 제시한다. 여기에 설명 된 FLS 콜라겐 조립 조건은 훨씬 더 많은 시간이 소요됩니다. 콜라겐 모노머는 아직 물에 대한 사전 dialyzed 할 필요가 있지만 대량으로 수행 한 후 ° C 안정적이 사용 될 때까지 4에 저장할 수 있습니다. 이 새로운 절차 수율은 주로 밴드 콜라겐 원 섬유를 FLS.
우리의 경험에서, α1-산성 glyco낮은 결합 단백질과 물이 콘텐츠와 단백질, 그리고 추론 높은 당도하여 성공적으로 FLS 원 섬유를 만드는 것이 중요합니다. 우리는 일반적으로 우리가 사용하는 α1-산성 당 단백질의 많은 82 이하의 결합 %의 단백질과 물이 콘텐츠가 있다는 것을 제조업체에 문의하십시오. 그리고 너무 오래 기본 콜라겐 합성, 콜라겐 모노머하는 절차로도 FLS의 콜라겐을 생산하는 고장이 발생할 수 있습니다. 또한, 투석에 사용되는 물의 순도는이 절차의 중요합니다. 예를 들어,도에 대한 콜라겐 모노머 ~ 8 MΩ.cm보다는 FLS의 콜라겐을 형성하지 않습니다 콜라겐 솔루션> 18 MΩ.cm 물 결과의 투석.
세 콜라겐 섬유 유형, 할 수있는 가장 쉬운는 SLS의 콜라겐입니다. SLS의 초기 준비는 슈미트와 동료 15 설명했다. 우리는 상업적으로 이용 가능한 coll를 사용하여 SLS의 콜라겐을위한 12 년 전 그 프로 시저의 적응을 발표agen 14. 절차는 간단하게 2 밀리그램 / ML ATP와 0.05 %에서 0.5 MG / 콜라겐 모노머의 ML (V / V) 산도 3.5 아세트산을 결합하고, 하루 아침에 실온에서 혼합을 떠날 entailed.
우리의 경험에서 제어 할 수 있어야합니다 SLS 조립의 중요한 점은 반응 솔루션의 pH입니다. SLS는 crystallites의 누적 clumps에 더 많은 기본 조건 (~ 산도를 3.6-3.9) 결과에 조립. 더 많은 산성 조건 (~ 산도를 2.9-3.2) 산도 3.3-3.5의 이상적인 조건 하에서 조립 사람들보다 얇은, 더 분리 crystallites의 결과입니다. 이 범위 (<2.8과> 4) 이외의 반응 PHS는 SLS 콜라겐를 얻을하지 않습니다. 과거에는, 우리는 아세트산을 추가하여 반응 혼합물의 pH를 조정. 더욱 절차를 단순화하기 위해이 원고에서 우리는 pH를 제어 할 수 글리신 – HCL 버퍼를 도입했습니다.
위에서 설명한 프로토콜에서 형성된 세 가지 콜라겐 구조는 문자가그 istic 기능은 나노 미터의 해상도를 할 수있는 수단으로 discerned 할 수 있습니다. 기본 및 FLS 콜라겐은 ~ 67 나노 미터와 ~ 270 nm의 periodicities을 구간을 특징으로하고 있습니다. SLS의 콜라겐의 긴 치수는 ~ 360 nm의 것입니다. 우리는 세 가지 콜라겐 구조를 특성화 AFM을 사용하는 방법 구체적으로 설명하고 있습니다. 단, AFM 프로브는 <10 나노 미터 반경을 가지는 연락처 또는 간헐적 접촉 모드에서 AFM 운영은 이미지이 콜라겐 구조를 할 수 있어야한다. 또한, 전자 현미경은 수 있으며 이러한 콜라겐 구조에게 19을 특징하는 데 사용되었습니다.
이러한 절차의 주요 이점은 그들이 원하는 콜라겐은 건설 주로 생산한다는 것입니다. 이 반응에서 찾을 수있다 콜라겐의 유일한 다른 형태는 종종 AFM 이미지의 배경에 표시됩니다 시작 단량체입니다. 기본 및 FLS 콜라겐의 경우, 그들은 쉽게 unrea의 대부분에서 분리 될 수물 결과 네이티브 또는 FLS 콜라겐 펠릿의 반복 원심 분리와 세척로 cted 단위체.
우리는 고급, 상업적으로 이용 가능한 출발 물질을 사용하여 원시, FLS와 SLS의 콜라겐을 만들기위한 간단하고 신뢰성이 절차를 제시했습니다. 이러한 모든 절차에 사용되는 콜라겐 모노머는 정화 형태로 상업적으로 사용할 수 있습니다. α1-산성 당 단백질과 ATP는 상업적으로도 가능에 있습니다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 우리의 실험실에서 콜라겐 fibrogenesis 연구를 위해 자신의 시간과 노력을 기부 한 모든 많은 과거의 학부, 대학원 및 사후 박사 학생을 감사드립니다. 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회는 지속적으로 우리의 콜라겐 연구를위한 기금을 제공하고 있습니다.
Materials
| Material/reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
| ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
| α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
| a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
| mica | Ted Pella | 53 | |
| Pointprobe – Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
| Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |
Referências
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