Enkel og reproduserbare fremgangsmåter er beskrevet for å lage tre strukturelt forskjellige kollagen forsamlinger fra en felles kommersielt tilgjengelig type I kollagen monomer. Native type, kan fibrøst lang avstand eller segmentell lang avstand kollagen konstrueres ved å variere de vilkår som gjelder 300 nm lang og 1,4 nm diameter monomer byggesten er eksponert.
Kollagen fibriller er tilstede i den ekstracellulære matriks av animalsk vev for å gi strukturell stillas og mekanisk styrke. Disse native kollagen fibriller har en karakteristisk banding periodisitet av ~ 67 nm og er dannet i vivo gjennom den hierarkiske montering av type I-kollagen monomerer, som er 300 nm i lengde og 1,4 nm i diameter. In vitro, ved å variere de vilkår som gjelder monomer byggesteinene er utsatt, kan unike strukturer som varierer i lengde skalerer opp til 50 mikron bygges, herunder ikke bare innfødte typen fibriller, men også fibrøst lang avstand og segmental lang avstand kollagen. Heri, presenterer vi prosedyrer for å danne de tre forskjellige kollagen strukturer fra en felles kommersielt tilgjengelig kollagen monomer. Bruke protokoller som vi og andre har publisert i det siste for å gjøre disse tre typene vanligvis føre til blandinger av strukturer. Spesielt var unbanded fibriller vanligvis found når du gjør innfødt kollagen, og innfødte fibriller var ofte til stede når du gjør fibrøst lang avstand kollagen. Disse nye fremgangsmåtene har den fordelen av å produsere den ønskede kollagen fibrill attraksjon nesten utelukkende. Dannelsen av de ønskede strukturer er bekreftet ved hjelp av en avbildning atommikroskop.
Kollagen er en klasse av strukturelle proteiner som har en trippel helisk struktur dannet fra tre polypeptidkjeder. Disse trippel spiralformede monomerer videre sammen i en hierarkisk måte å danne gradvis større strukturer. Det er minst 28 genetisk forskjellige kollagen typer som er identifisert 1. Kombinert, kollagener utgjør 30% av det totale protein som finnes i dyr, med type I den dominerende form står for opptil 90% av alle de kollagen proteiner 2. Type I kollagen er funnet som fibrillous strukturer i hud, leddbånd, sener og bein. Atommikroskop (AFM) og elektronmikroskop (EM) bilder av type I innfødte kollagenfibre typisk viser striper med en karakteristisk periode ~ 67 nm (ofte referert til som D-banding) 3-5.
Type I kollagen monomer er en trippel helisk heterotrimer bestående av to identiske α1 (I) kjeder og en α2 (I) kjeden, hver mer enn entusen aminosyrer lange. Det er lang og tynn med dimensjoner på 300 nm i lengde og 1,4 nm i diameter. Type I kollagen monomer kan lett oppnås ved å bryte ned naturlig dannet høyere orden strukturer 6. Vi 7 og mange andre 8-10 har vist at disse oppløselige monomer byggesteinene kan deretter brukes til å rekonstruere D-båndede fibriller in vitro (Figur 1).
I tillegg til innfødte kollagen fibriller, har to andre høyere ordens kollagen strukturer blitt funnet å danne in vitro ved hjelp av samme monomer byggeblokk. De to strukturene er fibrøs lang avstand (FLS) og segmental lang avstand (SLS) kollagen (Figur 1). FLS kollagen er en fibrillous konstruksjon som innfødt kollagen, men er preget av en større banding periodisitet enn innfødte kollagen 11. In vitro, danner FLS kollagen når kollagen monomer er kombinert med α1-glykoprotein <sup> 12. FLS kollagen har blitt observert in vivo også, selv om sjelden 13. SLS kollagen er beskrevet som krystallitter fordi monomerene er innrettet i register som i en krystallgitteret 14. SLS kollagen danner når kollagen monomer kombineres med adenosintrifosfat (ATP) 15. Naturlig forekommende SLS kollagen er blitt observert i dyrkningsmediet av fibroblaster, men ikke i utvunnet vevsprøver, sannsynligvis på grunn av sin lille størrelse og mangel på skjelnes topografiske trekk 16.
Målet med dette manuskriptet er å presentere detaljerte prosedyrer for å innfødte kollagen fibriller så vel FLS og SLS kollagen som selv den mest uerfarne forsker kan reprodusere. Hjelp av kommersielt tilgjengelige avanserte start materialer, har vi forsøkt å gjøre protokollene så enkelt som mulig og fortsatt jobbe dem har pålitelig. Vi har også detalj hvordan du bruker en AFM å karakterisere de forskjellige kollagen strukturs som er gjort. Dette arbeidet vil være fordelaktig for forskere som ønsker å studere ett eller flere av disse høyere ordens kollagen strukturer og / eller bruke dem som forløpere i andre programmer, men i dag mangler av kompetanse eller rett og slett ikke ønsker å jobbe med vevsprøver.
Renset kollagen monomer er stabil ved lav pH og temperatur og dannelse av innfødte kollagen fibriller hovedsak innebærer å heve pH og temperatur i kollagen monomer løsning. Prosedyrer for rekonstituering av banded kollagen fibriller fra monomerer har eksistert i mer enn 50 år. Prosedyren som vårt laboratorium som brukes i våre første studier med kollagen for 15 år siden 7 ble basert på prosedyrer oppsummert av Chapman og medarbeidere i 1986 10. Forholdene for kollagen fibrill formasjonen i denne tidligere arbeidet var 0,18 mg / ml kollagen monomer i Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) buffer ved 34 ° C. Ulempen med denne og andre prosedyrer som vi har prøvd er at det er alltid unbanded fibriller dannet sammen de ønskede banded fibriller. Våre nye forholdene er ~ 0,3 mg / ml av kollagen monomer i 100 mM fosfat og 100 mM KCl ved pH 7 igjen på 37 ° C i 3-4 timer. ProceDure beskrevet forskjellig i alle aspekter fra tidligere prosedyre for å lage innfødte kollagen fibriller. Men mest merkbart har vi doblet ionestyrken ved å heve buffer konsentrasjon og tilsette 100 mM KCl. Økningen i ionestyrke resulterer i mer konsekvent dannelsen av utelukkende banded kollagen fibriller.
I vår erfaring, var de eneste ganger at denne prosedyren ikke har produsert innfødte typen kollagen når kollagen monomer løsningen var forbi produsentens anbefalte dato for bruk. Når dette skjer, er det observert varierer fra færre fibriller som alle unbanded til mange fibriller fortsatt observert, men hovedsakelig unbanded. Vær oppmerksom på at utløpt kollagen monomer kan ofte bli brukt til å lage innfødte kollagen, men når det mislykkes, bør nye kollagen monomer definitivt kjøpes.
FLS ble først identifisert av Highberger et al. 17 i kollagen preparater kreditert Orekhovich et al. 18. Videre studier ledet Highberger og Schmitt å konkludere med at det var α1-glykoprotein som fremmer dannelsen av FLS 12. Vi var i stand til å replikere senere Framgangsmåten FLS kollagen ved å kombinere kommersielt tilgjengelige kollagen monomer og α1-syre glykoprotein ved lav pH og langsomt la pH å stige med dialyzing blandingen mot vann i 24 timer 11. Presenterer vi en modifikasjon av den prosedyren ved dialyzing kollagen monomer mot vann først og bare å kombinere den med α1-syre glykoprotein i vann for å danne FLS kollagen. Vilkårene for FLS kollagen montering beskrevet her er mye mindre tidkrevende. Kollagen monomer trenger fortsatt å være pre-dialysert mot vann, men det kan gjøres i bulk, og deretter lagres ved 4 ° C stabilt inntil det brukes. Denne nye prosedyren gir FLS hovedsakelig banded kollagen fibriller.
Fra vår erfaring, α1-syre glycoprotein med en lavere kombinert protein og vanninnhold, og ved slutning høyere sukkerinnhold, er avgjørende for vellykket lage FLS fibriller. Vi vanligvis sjekke med produsenten om at α1-syre glykoprotein mye vi bruker har en kombinert% protein og vanninnhold på 82 eller mindre. Og som med framgangsmåten for native kollagensyntesen, kollagen monomer som er for gamle kan også resultere i svikt å produsere FLS kollagen. I tillegg, er renheten av vannet som brukes til dialyse kritisk i denne prosedyren. For eksempel, dialyse av kollagen monomer mot selv ~ 8 MΩ.cm snarere enn> 18 MΩ.cm vann resulterer i en kollagen-løsning som ikke vil danne FLS kollagen.
Av de tre kollagen fibril typer, er den enkleste å lage SLS kollagen. Den tidligste utarbeidelse av SLS ble beskrevet av Schmitt og medarbeidere 15. Vi publiserte en tilpasning av den prosedyren for 12 år siden for å gjøre SLS kollagen hjelp av kommersielt tilgjengelige collagen 14. Prosedyren simpelthen innebar kombinere 2 mg / ml ATP og 0,5 mg / ml av kollagen monomer i 0,05% (v / v) eddiksyre ved pH 3,5, og forlater blandingen ved romtemperatur over natten.
Etter vår erfaring er den kritiske aspektet av SLS montering som må kontrolleres pH i reaksjonsløsningen. SLS samlet i mer grunnleggende forhold (~ pH 3.6 til 3.9) resultater i aggregerte klumper av krystallitter. Mer sure forhold (~ pH 2.9 til 3.2) resulterer i tynnere, mer atskilt krystallitter enn de samlet under ideelle forhold med pH 3.3 til 3.5. Reaksjons pH-verdier utenfor dette området (<2,8 og> 4) ikke gir noen SLS kollagen. I det siste, justert vi pH av reaksjonsblandingen ved tilsetning av eddiksyre. For å forenkle prosedyren ytterligere, i dette manuskriptet introduserte vi en glycin-HCl-buffer for å kontrollere pH.
De tre forskjellige kollagen strukturer dannet fra protokollene beskrevet ovenfor har tegnetrealistisk funksjoner som bare kan fanges av virkemidler som kan nanometer oppløsning. Innfødte og FLS kollagen er preget av banding periodicities av ~ 67 nm og ~ 270 nm. Den lengste dimensjon SLS kollagen er bare ~ 360 nm. Vi har beskrevet spesielt hvordan vi bruker en AFM å karakterisere de tre ulike kollagen strukturer. Men eventuelle AFM opererer i kontakt eller periodisk kontakt modus med alle AFM-probe med <10 nm radius også kunne image disse kollagen strukturer. I tillegg kan elektronmikroskopi være og har vært brukt for å karakterisere disse kollagen strukturene 19.
Den store fordelen med disse prosedyrene er at de produserer hovedsakelig den ønskede kollagen konstruere. Den eneste andre formen av kollagen som er funnet i disse reaksjonene er utgangsmaterialet monomer, som er ofte synlig i bakgrunnen av AFM bildene. I tilfelle av innfødte og FLS kollagen, kan de lett skilles fra det meste av uricted monomer ved gjentatt sentrifugering og vasking av det resulterende innfødte eller FLS kollagen pellet med vann.
Vi har presentert enkle og pålitelige rutiner for å lage innfødte, FLS og SLS kollagen ved hjelp av avanserte, kommersielt tilgjengelige utgangsmaterialer. Kollagen monomer brukes i alle disse prosedyrene er kommersielt tilgjengelig i en renset form. α1-glykoprotein og ATP er også begge tilgjengelig kommersielt.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke alle de mange tidligere lavere, graduate og post-doktor studenter som har medvirket sin tid og krefter til studiet av kollagen fibrogenesis i vårt laboratorium. Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada har kontinuerlig gitt midler til våre kollagen studier.
Material/reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
mica | Ted Pella | 53 | |
Pointprobe – Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |