Eenvoudige en reproduceerbare procedures beschreven voor het maken van drie structureel onderscheiden collageen samenstellingen van een gemeenschappelijke handel verkrijgbare Type I collageen monomeer. Inheemse type, kan vezelig lange afstand of segmentale lange afstand collageen worden opgebouwd door het variëren van de voorwaarden voor de 300 nm lang en 1,4 nm diameter monomeer bouwsteen wordt blootgesteld.
Collageenvezels aanwezig in de extracellulaire matrix van dierlijk weefsel structurele steigers en mechanische sterkte. Deze native collageenfibrillen een karakteristieke strepen periodiciteit van ~ 67 nm en zijn gevormd in vivo door de hiërarchische samenstelling van Type I collageen monomeren, die 300 nm lang en 1,4 nm in diameter. In vitro, door variatie van de voorwaarden voor de monomeer bouwstenen worden blootgesteld, kunnen unieke structuren, variërend in lengte schalen tot 50 micron worden gebouwd, waaronder niet alleen inheemse soort fibrillen, maar ook vezelig lange afstand en segmentale lange afstand collageen. Hierin presenteren we procedures voor het vormen van de drie verschillende collageenstructuren een gemeenschappelijke handel verkrijgbare collageen monomeer. Met behulp van de protocollen die wij en anderen hebben gepubliceerd in het verleden om deze drie soorten maken doorgaans leiden tot mengsels van structuren. In het bijzonder, unbanded fibrillen waren vaak feluid bij het maken van inheemse collageen, en inheemse fibrillen waren vaak aanwezig bij het maken van vezelige lange afstand collageen. Deze nieuwe procedures hebben het voordeel van het gewenste soort collageen fibrillen vrijwel uitsluitend. De vorming van de gewenste structuren wordt gecontroleerd door beeldvorming met een atomic force microscope.
Collageen is een klasse van structurele eiwitten die een drievoudige helixstructuur bestaat uit drie polypeptide ketens. Deze triple helix monomeren verder verzamelen op een hiërarchische wijze steeds grotere structuren. Er zijn ten minste 28 genetisch verschillende collageentypes geïdentificeerde 1. Gecombineerd, collagenen goed voor 30% van het totale eiwit dat voorkomt bij dieren, met Type I de meest voorkomende vorm goed voor maximaal 90% van alle collageen eiwitten 2. Type I collageen wordt gevonden als fibrillous structuren in de huid, ligamenten, pezen en botten. Atomic Force Microscope (AFM) en elektronenmicroscoop (EM) beelden van Type I inheemse collageenvezels Typisch voor banding met een karakteristieke periode van ~ 67 nm (vaak aangeduid als D-banding) 3-5.
Type I collageen monomeer een triple helix heterotrimeer bestaande uit twee identieke α1 (I)-ketens en een α2 (I)-keten, elk meer dan eenduizend aminozuren lang. Het is lang en dun met afmetingen van 300 nm lang en 1,4 nm in diameter. Type I collageen monomeer kan gemakkelijk worden verkregen door het afbreken van nature gevormd hogere orde structuren 6. We 7 en vele anderen 8-10 hebben aangetoond dat deze oplosbaar monomeer bouwstenen vervolgens kan worden gebruikt om D-banded fibrillen in vitro (figuur 1) te reconstrueren.
Naast natief collageen fibrillen zijn twee andere hogere orde collageenstructuren gevonden te vormen in vitro met dezelfde monomeer bouwstenen. Beide structuren zijn vezelachtige lange afstand (FLS) en segmentale lange afstand (SLS) collageen (figuur 1). FLS collageen een fibrillous construct als natief collageen, maar wordt gekenmerkt door een grotere frequentie dan banding natief collageen 11. In vitro FLS collageen vormt wanneer het collageen monomeer wordt gecombineerd met α1-zuur glycoproteïne <sup> 12. FLS collageen waargenomen in vivo, hoewel zelden 13. SLS collageen wordt beschreven als kristallieten omdat de monomeren worden uitgelijnd in register als in een kristalrooster 14. SLS collageen vormt wanneer het collageen monomeer wordt gecombineerd met adenosine trifosfaat (ATP) 15. Natuurlijk voorkomende SLS collageen waargenomen in het kweekmedium van fibroblasten maar niet in geëxtraheerde weefselmonsters, waarschijnlijk vanwege de kleine omvang en het gebrek van onderscheidbare topografische kenmerken 16.
Het doel van dit manuscript is de presentatie van gedetailleerde procedures voor het maken van inheemse collageenvezels en FLS en SLS collageen dat zelfs de meest onervaren onderzoeker kan reproduceren. Met behulp van in de handel verkrijgbare geavanceerde uitgangsmaterialen, hebben we geprobeerd om de protocollen zo eenvoudig mogelijk te maken en nog steeds hebben ze betrouwbaar werken. We hebben ook uitvoerig in op hoe een AFM te gebruiken om de verschillende collageen structuur karakteriserens die worden gemaakt. Dit werk zal zijn voor onderzoekers die willen een of meer van deze hogere orde collageen structuren te bestuderen en / of te gebruiken als voorlopers in andere toepassingen, maar op dit moment ontbreekt van de expertise of gewoon niet willen werken met weefselmonsters.
Gezuiverd collageen monomeer stabiel bij lage pH en temperatuur en de vorming van natief collageen fibrillen hoofdzakelijk bestaat verhogen van de pH en temperatuur van de collageen monomeeroplossing. Procedures voor de reconstitutie van gestreepte collageen fibrillen uit monomeren bestaan al meer dan 50 jaar. De procedure die ons laboratorium in de eerste studies met collageen 15 jaar geleden 7 is gebaseerd op procedures samengevat door Chapman en medewerkers in 1986 10. De voor collageen fibrilvorming in die eerdere werk waren 0,18 mg / ml collageen in monomeer Na 2 HPO 4 / KH 2PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) buffer bij 34 ° C. Het nadeel van deze en andere procedures die we hebben geprobeerd is dat er altijd unbanded fibrillen gevormd naast de gewenste gestreepte fibrillen. Onze nieuwe condities ~ 0,3 mg / ml collageen monomeer in 100 mM fosfaat en 100 mM KCl bij pH 7 op 37 ° C gedurende 3-4 uur. De proceduredure beschreven verschilt in elk aspect van de eerdere procedure voor het natieve collageenvezels. Maar het meest opvallend, hebben we verdubbeld de ionsterkte door verhoging van de bufferconcentratie en met 100 mM KCl. De toename in ionsterkte resulteert in meer consistente vorming van uitsluitend gestreept collageenfibrillen.
In onze ervaring, de enige keer dat deze procedure niet heeft eigen type collageen was toen de collageen monomeer oplossing was voorbij door de fabrikant aanbevolen datum van gebruik. Wanneer dit gebeurt, is wat waargenomen varieert van minder fibrillen die allemaal unbanded veel fibrillen nog steeds waargenomen maar overwegend unbanded. Merk op dat verlopen collageen monomeer kan vaak nog met succes worden gebruikt om inheemse collageen te maken, maar als het niet lukt, nieuw collageen monomeer moet zeker worden gekocht.
FLS werd voor het eerst geïdentificeerd door Highberger et al.. 17 in collageen voorbereidingen bijgeschreven op Orekhovich et al.. 18. Verdere studies leidde Highberger en Schmitt om te concluderen dat het α1-zuur glycoproteïne, dat de vorming van FLS 12 bevordert. We waren in staat om later de procedure voor het maken repliceren FLS collageen door het combineren van in de handel verkrijgbare collageen monomeer en α1-zuur glycoproteïne bij lage pH en langzaam waardoor de pH te stijgen door dialyseren tegen water het mengsel gedurende 24 uur 11. Presenteren we nu een wijziging van die procedure door dialyseren het collageen monomeer tegen water eerst en eenvoudig te combineren met α1-zuur glycoproteïne in water om FLS collageen te vormen. De voorwaarden voor FLS collageen montage beschreven veel minder tijdrovend. Het collageen monomeer moet nog vooraf worden gedialyseerd tegen water, maar het kan in bulk en vervolgens opgeslagen bij 4 ° C stabiel totdat het wordt gebruikt. Deze nieuwe procedure levert FLS voornamelijk gestreepte collageenvezels.
Vanuit onze ervaring, α1-zuur glycoeiwit met een lagere gecombineerde eiwitten en het watergehalte, en door gevolgtrekking hoger suikergehalte, is van cruciaal belang voor het succesvol maken van FLS fibrillen. We meestal met de fabrikant dat de α1-zuur glycoproteïne veel dat we gebruik maken van een gecombineerde% eiwit en het watergehalte van 82 of minder heeft. En als de procedure voor natief collageen, collageen monomeer dat te oud is kan ook resulteren in het feit dat FLS collageen. Bovendien is de zuiverheid van het water voor de dialyse is essentieel in deze procedure. Bijvoorbeeld dialyse van collageen monomeer zelfs tegen ~ 8 MΩ.cm plaats> 18 MΩ.cm water resulteert in een collageenoplossing die niet zullen FLS collageen.
Van de drie collageen fibrillen vormen, het makkelijkst te maken is SLS collageen. De vroegste bereiding van SLS werd door Schmitt en medewerkers 15. Publiceerden we een aanpassing van deze procedure 12 jaar geleden voor het maken van SLS collageen met behulp van in de handel verkrijgbare collagen 14. Het eenvoudigweg gepaard combineren van 2 mg / ml ATP en 0,5 mg / ml collageen in monomeer 0,05% (v / v) azijnzuur bij pH 3,5, en laat het mengsel bij kamertemperatuur geroerd.
In onze ervaring, de kritische aspect van SLS samenstelling die moet worden beheerst de pH van de reactieoplossing. SLS geassembleerd in meer basisvoorwaarden (~ pH 3.6 tot 3,9) resulteert in geaggregeerde groepjes van kristallieten. Meer zure omstandigheden (pH ~ 2.9-3.2) resulteert in dunnere, meer gescheiden kristallieten dan die gemonteerd onder de ideale omstandigheden van pH 3,3-3.5. Reactie pH buiten dit bereik (<2.8 en> 4) geen enkel element SLS collageen. In het verleden hebben we bijgesteld de pH van het reactiemengsel door toevoeging van azijnzuur. De procedure nog verder te vereenvoudigen, in dit manuscript wij een glycine-HCl buffer om de pH te controleren.
De drie verschillende collageen structuren gevormd uit de hierboven beschreven protocollen hebben karakterrealistische functies die alleen kan worden onderscheiden door de instrumenten die in staat van nanometer resolutie. Inheemse en FLS collageen worden gekenmerkt door strepen periodiciteiten van ~ 67 nm en ~ 270 nm. De langste afmeting van SLS collageen slechts ~ 360 nm. We hebben specifiek beschreven hoe we een AFM gebruiken om de drie collageenstructuren karakteriseren. Daarbij moet echter niet AFM die in contact of intermitterend contact functie met AFM probe met <10 nm radius ook kunnen deze afbeelding collageenstructuren. Bovendien kunnen elektronenmicroscopie zijn en is gebruikt om karakteriseren collageenstructuren 19.
Het grote voordeel van deze procedures is dat zij overwegend de gewenste collageen construeren. De enige andere vorm van collageen die in deze reacties is het uitgangsmonomeer, die vaak zichtbaar op de achtergrond van de AFM afbeeldingen. In het geval van natuurlijke en FLS collageen, kunnen ze gemakkelijk worden gescheiden van de meeste unreaCTED monomeer door herhaalde centrifugeren en wassen van de resulterende natieve of FLS collageen pellet met water.
We hebben gepresenteerd eenvoudige en betrouwbare procedures voor het maken van native, FLS en SLS collageen met behulp van geavanceerde, commercieel verkrijgbare uitgangsmaterialen. Het collageen monomeer dat in al deze procedures is commercieel verkrijgbaar in een gezuiverde vorm. α1-zuur glycoproteïne en ATP zijn ook beide in de handel verkrijgbaar.
The authors have nothing to disclose.
We willen graag de vele voorbije bachelor-, master-en post-doctorale studenten die hun tijd en moeite bijgedragen aan de studie van collageen fibrogenese in ons laboratorium bedanken. The Natural Sciences and Engineering Research Council van Canada voortdurend financiële steun verstrekt voor onze collageen studies.
Material/reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
mica | Ted Pella | 53 | |
Pointprobe – Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |