ووصف إجراءات بسيطة وقابلة للتكرار لصنع الكولاجين ثلاث جمعيات متميزة هيكليا من نوع شائع المتاحة تجاريا I مونومر الكولاجين. نوع الأصلي، ويمكن أن تبنى تباعد طويلة ليفية أو قطعي الكولاجين تباعد طويل من خلال تغيير الظروف التي تكون طويلة و300 نانومتر يتعرض 1،4 نانومتر مونومر قطر بنة.
ييفات الكولاجين موجودة في المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة الحيوانية لتوفير السقالات الهيكلية والقوة الميكانيكية. هذه الألياف الكولاجين الأصلي لها دورية مميزة النطاقات من 67 نانومتر ~ وتتكون في الجسم الحي من خلال الجمعية هرمية من نوع الكولاجين مونومرات I، والتي هي 300 نانومتر في الطول و 1.4 نانومتر في القطر. في المختبر، من خلال تغيير الظروف التي تكون ويتعرض اللبنات مونومر، يمكن بناء هياكل فريدة من نوعها تتراوح في جداول طول مدة تصل إلى 50 ميكرون، بما في ذلك ليس فقط الألياف نوع الأصلي، ولكن أيضا ليفية طويلة تباعد وقطعي الكولاجين تباعد طويل هنا، نقدم إجراءات تشكيل الكولاجين ثلاثة هياكل مختلفة من مونومر المشتركة الكولاجين متوفرة تجاريا. باستخدام البروتوكولات التي نحن وغيرنا قد نشرت في الماضي لجعل هذه الأنواع الثلاثة تؤدي عادة إلى مزيج من الهياكل. على وجه الخصوص، كانت الألياف عادة و unbandedound عند اتخاذ الكولاجين الأصلية، والألياف الأصلية كانت غالبا ما تكون موجودة عند اتخاذ الليفية الكولاجين تباعد طويل. هذه الإجراءات الجديدة لديها ميزة إنتاج الكولاجين المطلوب نوع يفية على وجه الحصر تقريبا. يتم التحقق من تشكيل الهياكل المطلوبة عن طريق التصوير باستخدام مجهر القوة الذرية.
الكولاجين هو فئة من البروتينات الهيكلية التي يكون لها هيكل ثلاثي حلزونية تكونت من ثلاث سلاسل ببتيد. هذه مونومرات الثلاثي حلزونية تجميع مزيد بطريقة الهيكل التنظيمي لتشكيل هياكل أكبر تدريجيا. هناك ما لا يقل عن 28 أنواع مختلفة وراثيا الكولاجين التي تم تحديدها 1. مجتمعة، تشكل الكولاجين 30٪ من البروتين الكلي وجدت في الحيوانات، مع النوع الأول الشكل السائد المحاسبة لمدة تصل إلى 90٪ من مجموع بروتينات الكولاجين و2. تم العثور على النوع الأول الكولاجين والهياكل fibrillous في الجلد، والأوتار والأربطة والعظام. مجهر القوة الذرية (AFM) والمجهر الالكتروني (EM) صور النوع الأول ألياف الكولاجين الأصلية عادة ما تظهر النطاقات مع فترة 67 نانومتر من سمات ~ (غالبا ما يشار إليها باسم D-النطاقات) 3-5.
النوع الأول الكولاجين مونومر هو heterotrimer حلزونية ثلاثية تتكون من اثنين من α1 متطابقة (I) سلاسل واحد α2 (I) السلسلة، أكثر من كلألف الأحماض الأمينية طويلة. وهو طويل ورقيقة مع أبعاد 300 نانومتر في الطول و 1.4 نانومتر في القطر. النوع الأول يمكن الحصول عليها بسهولة مونومر الكولاجين عن طريق تحطيم هياكل تشكلت طبيعيا مرتبة أعلى 6. لقد أظهرنا الكثير من 8-10 7 و غيرها من الجهات التي يمكن بعد هذه مونومر ذوبان كتل بناء يمكن استخدامها لإعادة بناء D-النطاقات الألياف في المختبر (الشكل 1).
بالإضافة إلى الألياف الكولاجين الأصلية، تم العثور على اثنين آخرين الكولاجين أعلى ترتيب لتشكيل الهياكل في المختبر باستخدام بناء مونومر نفس الكتلة. الهياكل هما تباعد طويلة ليفية (FLS) وتباعد طويل قطعي (SLS) الكولاجين (الشكل 1). FLS الكولاجين هو بناء fibrillous مثل الكولاجين الأصلية، ولكن يتميز أكبر من الكولاجين دورية النطاقات المحلية 11. في المختبر، FLS الكولاجين تتشكل عندما يتم الجمع بين مونومر مع الكولاجين بروتين سكري الحمضية α1 <suف> 12. وقد لوحظ FLS الكولاجين في الجسم الحي أيضا، على الرغم من أن نادرا ما 13. يوصف SLS الكولاجين وcrystallites ليتم محاذاة مونومرات في سجل مثل في الكريستال المشبك 14. SLS تشكل الكولاجين عندما يتم الجمع بين مونومر الكولاجين مع الأدينوساين ثلاثي (ATP) 15. وقد لوحظ التي تحدث بشكل طبيعي SLS الكولاجين في الخلايا الليفية المتوسطة ثقافة ولكن ليس في عينات الأنسجة المستخرجة. الأرجح بسبب صغر حجمها وعدم وجود ميزات الطبوغرافية مميزة 16
والهدف من هذا المخطوط هو تقديم الإجراءات التفصيلية لصنع الألياف الكولاجين الأصليين FLS جيدا وSLS الكولاجين أنه حتى الباحثين الأكثر الحاحا في الخبرة يمكن أن تتكاثر. استخدام المواد المتقدمة المتاحة تجاريا البداية، حاولنا جعل البروتوكولات بسيطة قدر الإمكان والعمل لا يزال يكون لهم بشكل موثوق. ونحن أيضا بالتفصيل كيفية استخدام AFM لوصف بنية الكولاجين مختلفةق التي يتم إجراؤها. وهذا العمل يكون مفيدا للباحثين الذين يرغبون في دراسة واحدة أو أكثر من هذه الهياكل أجل أعلى الكولاجين و / أو استخدامها كما السلائف في تطبيقات أخرى، ولكنها تفتقر حاليا من الخبرات أو ببساطة لا يرغبون في العمل مع عينات الأنسجة.
تنقية مونومر الكولاجين هو مستقر في انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة وتشكيل الكولاجين الألياف الأصلي ينطوي أساسا رفع درجة الحموضة ودرجة حرارة الكولاجين حل مونومر. وقد وجدت إجراءات لإعادة تشكيل الكولاجين الألياف النطاقات من مونومرات لأكثر من 50 عاما. تلخيص الإجراء الذي مختبرنا المستخدمة في دراساتنا الأولى مع الكولاجين قبل 15 عاما واستند 7 على الإجراءات التي تشابمان وزملاء العمل في 1986 10. وكانت الظروف لتشكيل الكولاجين لييف في هذا العمل في وقت سابق 0.18 مغ / مل من الكولاجين في مونومر نا 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0.2، ودرجة الحموضة 7.4) المخزن المؤقت في 34 ° C. والعيب في هذه وغيرها من الإجراءات التي حاولنا أن هناك الألياف unbanded دائما إلى جانب تشكيل لييفات النطاقات المطلوب. شروطنا الجديدة ~ 0.3 ملغ / مل من الكولاجين في مونومر الفوسفات 100 ملم و 100 ملم على بوكل الرقم الهيدروجيني 7 غادر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 3-4. اإلجراءاتوصف dure هنا يختلف في كل جانب من جوانب من الإجراء في وقت سابق لصنع الألياف الكولاجين الأصلية. ولكن معظم بشكل ملحوظ، ونحن قد تضاعفت قوة الأيونية عن طريق رفع تركيز العازلة وبإضافة 100 ملي بوكل. الزيادة في نتائج القوة الأيونية في تشكيل أكثر اتساقا من الألياف الكولاجين النطاقات حصرا.
في تجربتنا، وكان مرات فقط أن هذا الإجراء لم تنتج الكولاجين نوع الأصلية عندما حل مونومر الكولاجين بعد موعد أوصت الشركة المصنعة للاستخدام. وعندما يحدث هذا، لوحظ ما يتراوح بين أقل الألياف التي unbanded جميع لاحظ العديد من الألياف ولكن لا يزال يغلب عليها الطابع unbanded. نلاحظ أن منتهية الصلاحية مونومر الكولاجين وغالبا ما يزال استخدامها بنجاح لجعل الكولاجين الأصلية، ولكن عندما فشل في ذلك يتعين شراؤها جديدة مونومر بالتأكيد أن الكولاجين.
كان أول من عرف من FLS Highberger وآخرون 17 في التحضيرات الكولاجين لحساب Orekhovicح وآخرون 18. أدى إجراء المزيد من الدراسات وHighberger شميت أن نستنتج أن كان بروتين سكري الحمضية α1 تعزز تشكيل FLS 12. كنا في وقت لاحق قادرة على تكرار الإجراء لصنع الكولاجين من خلال الجمع بين FLS المتاحة تجاريا مونومر الكولاجين وبروتين سكري الحمضية α1 في انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحموضة مما يسمح ببطء ليرتفع بنسبة dialyzing الخليط ضد الماء لمدة 24 ساعة 11. نقدم الآن تعديل هذا الإجراء من قبل dialyzing المونمر الكولاجين ضد الماء أولا والجمع ببساطة مع α1 بروتين سكري الحمضية في الماء لتكوين الكولاجين FLS. شروط FLS الكولاجين الجمعية الموصوفة هنا هي اقل بكثير من مضيعة للوقت. ومونومر الكولاجين لا تزال بحاجة إلى أن تكون قبل مدال ضد المياه، ولكن يمكن أن يتم ذلك في معظم وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية حتى ستابلي استخدامها. هذا الإجراء الجديد غلة FLS في الغالب ييفات الكولاجين النطاقات.
من تجربتنا، α1 الحمضية غليكوالبروتين مع البروتين والماء أقل مجتمعة، وفقا للمحتوى الاستدلال أعلى السكر، أمر بالغ الأهمية لصنع الألياف FLS بنجاح. ونحن عادة تحقق مع الشركة المصنعة أن الكثير بروتين سكري الحمضية α1 التي نستخدمها ومجتمعة نسبة البروتين والماء من 82٪ أو أقل. ويمكن كما هو الحال مع الإجراء لتخليق الكولاجين الأصلية، مونومر الكولاجين ما هو قديم جدا يؤدي أيضا إلى عدم إنتاج الكولاجين FLS. وبالإضافة إلى ذلك، على نقاء المياه المستخدمة لغسيل الكلى أمر بالغ الأهمية في هذا الإجراء. على سبيل المثال، غسيل الكلى من مونومر الكولاجين حتى ضد ~ 8 MΩ.cm بدلا من> الماء MΩ.cm 18 نتيجة في حل الكولاجين التي لن تشكل الكولاجين FLS.
ثلاثة أنواع من الكولاجين ليفية، وأسهل لجعل هو SLS الكولاجين. ووصف أقرب إعداد SLS بواسطة شميت وزملاء العمل-15. نشرنا على التكيف من هذا الإجراء قبل 12 عاما لصنع الكولاجين باستخدام SLS كول المتاحة تجارياآجا 14. الإجراء ينطوي ببساطة الجمع بين 2 ملغ / مل و 0.5 ATP ملغ / مل من الكولاجين في مونومر 0.05٪ (V / V) حامض الخليك في درجة الحموضة 3.5، وترك الخليط في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
في تجربتنا، وجانبا مهما من الجمعية SLS التي يجب أن يسيطر هو الرقم الهيدروجيني للمحلول التفاعل. SLS تجميعها في ظروف أكثر الأساسية (درجة الحموضة 3،6-3،9 ~) النتائج المجمعة في كتل من crystallites. أكثر حمضية الظروف (درجة الحموضة 2،9-3،2 ~) النتائج في crystallites أرق، وأكثر من فصل تلك التي جمعت تحت الظروف المثالية من درجة الحموضة 3،3-3،5. بالوسط رد فعل خارج هذا النطاق (<2.8 و> 4) لا تسفر عن أي الكولاجين SLS. في الماضي، نحن تعديل الرقم الهيدروجيني للخليط التفاعل عن طريق إضافة حمض الخليك. لتبسيط الإجراء إلى أبعد من ذلك، في هذه المخطوطة قدمنا منطقة عازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك للسيطرة على الرقم الهيدروجيني.
ثلاثة هياكل مختلفة الكولاجين تكونت من البروتوكولات المذكورة أعلاه لها طابعلا يمكن إلا أن ميزات istic يمكن تمييزها عن طريق الصكوك قادرة على قرار نانومتر. وتتميز الكولاجين الأصلية وFLS من النطاقات دوريات من 67 نانومتر ~ و ~ نانومتر 270. أطول البعد الكولاجين SLS هو مجرد ~ نانومتر 360. وقد وصفت ونحن على وجه التحديد كيفية استخدام AFM لوصف ثلاثة هياكل الكولاجين مختلفة. ومع ذلك، فإن أي AFM التشغيل على اتصال متقطع أو وضع أي اتصال مع التحقيق AFM وجود <دائرة نصف قطرها 10 نانومتر تكون ايضا قادرة على صورة هذه الهياكل الكولاجين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون الإلكترون المجهري واستخدمت لوصف هذه الهياكل الكولاجين 19.
والميزة الرئيسية لهذه الإجراءات هو أنها تنتج في الغالب بناء الكولاجين المطلوب. الشكل الوحيد أخرى من الكولاجين التي وجدت في ردود الفعل هذه هو مونومر انطلاق، التي غالبا ما تكون وضوحا في الخلفية من الصور AFM. في حالة الكولاجين الأصلية وFLS، يمكن انهما انفصلا بسهولة من معظم unreaالمديرية مونومر بواسطة الطرد المركزي المتكررة وغسل الأم أو الناتجة FLS بيليه الكولاجين بالماء.
قدمنا إجراءات بسيطة وموثوق بها لجعل الأم، والكولاجين FLS SLS باستخدام المتقدمة، متوفرة تجاريا المواد الأولية. ومونومر الكولاجين المستخدمة في كل هذه الإجراءات هي متاحة تجاريا في شكل منقى. α1 بروتين سكري الحمضية وATP هي أيضا وكلاهما متاح تجاريا.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر جميع الماضي الجامعية كثيرة، طلاب الدراسات العليا وما بعد الدكتوراه الذين ساهموا وقتهم وجهدهم لدراسة تكون الألياف الكولاجين في مختبرنا. قدمت العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا باستمرار تمويل دراسات الكولاجين لدينا.
Material/reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
mica | Ted Pella | 53 | |
Pointprobe – Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |