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Neurociência

Dissection, Kultur und Analyse der<em> Xenopus laevis</em> Embryonic Netzhautgewebe

Published: December 23, 2012
doi:
10.3791/4377
, , , , ,
1Department of Biology,College of William and Mary

Summary

Xenopus laevis bietet ein ideales Modellsystem zur Untersuchung von Zell Schicksal Spezifikation und physiologische Funktion der einzelnen Zellen der Netzhaut in primären Zellkulturen. Hier stellen wir eine Technik zum Präparieren Netzhautgewebe und Erzeugen primären Zellkulturen, die für Calcium-Aktivität abgebildet und analysiert werden durch in situ-Hybridisierung.

Abstract

Der Prozess, durch den vorderen Bereich des Neuralplatte ergibt sich die Retina von Wirbeltieren weiterhin ein wichtiger Schwerpunkt der klinischen und der Grundlagenforschung sein. Neben der offensichtlichen medizinischen Relevanz für das Verständnis und die Behandlung von Netzhauterkrankungen, weiterhin die Entwicklung der Retina von Wirbeltieren als ein wichtiges und elegantes Modell für das Verständnis neuronaler Zelltyp Bestimmung und Unterscheidung 1-16 dienen. Das neurale Retina besteht aus sechs diskrete Zelltypen (Ganglion amakrinen, horizontal, Fotorezeptoren, bipolaren Zellen, und Müller Gliazellen) in stereotypen Schichten angeordnet sind, ein Muster, das weitgehend unter allen Vertebraten 12,14-18 konserviert ist.

Während des Studiums der Netzhaut im intakten entwickelnden Embryo ist eindeutig für das Verständnis erforderlich, wie dieses komplexe Organ von einem Vorsprung des Vorderhirns in eine geschichtete Struktur entwickelt, gibt es viele Fragen, die fro profitierenm Einsatz Ansätze unter Verwendung von primären Zellkulturen von mutmaßlichem Netzhautzellen 7,19-23. Beispielsweise Analysieren von Zellen aus Geweben entfernt und dissoziiert in verschiedenen Phasen ermöglicht es, den Stand der Spezifikation der einzelnen Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien unterscheiden, das heißt, das Schicksal der Zellen in Abwesenheit von Wechselwirkungen mit benachbarten Geweben 8,19-22 ,24-33. Primäre Zellkultur ermöglicht auch die Ermittler, die Kultur mit spezifischen Reagenzien zu behandeln und analysieren die Ergebnisse auf einer einzigen Zellebene 5,8,21,24,27-30,33-39. Xenopus laevis, ein klassisches Modellsystem für die Untersuchung von frühen neuralen Entwicklung 19,27,29,31-32,40-42, dient als ein besonders geeignetes System zur Netzhaut primäre Zellkultur 10,38,43-45.

Mutmaßlich Netzhautgewebe ist von den frühesten Stadien der Entwicklung, unmittelbar nach neuralen Induktion 25,38,43. Darüber hinaus, th gegebenbei dem jede Zelle im Embryo eines Vorrats von Eigelb enthält, retinaler Zellen in einem sehr einfachen definierten Medien, bestehend aus einer gepufferten Salzlösung kultiviert werden, wodurch das Entfernen der Wirkung von Störfaktoren Inkubation Seren oder anderen Produkten auf 10,24,44-45 .

Allerdings ist die Isolierung des Retinagewebe vom umgebenden Gewebe und der nachfolgenden Verarbeitung schwierig. Hier stellen wir ein Verfahren zur Präparation und Dissoziation von Retinazellen in Xenopus laevis, die zum primären Zellkulturen, die wiederum für Calcium Aktivität und Genexpression bei der Auflösung von einzelnen Zellen analysiert werden vorbereitet wird. Während das Thema in diesem Papier ist die Analyse der spontanen Kalzium Transienten ist die Technik breit anwendbar auf ein breites Spektrum von Fragestellungen und Ansätze (Abbildung 1).

Protocol

Alle Versuche werden folgende Protokolle durch die Institutional Animal Care und Use Committee am College of William and Mary genehmigte durchgeführt. Entwicklungsstadien in diesem Protokoll verwiesen werden nach Nieuwkoop and Faber 46. Ein. Präparation Lassen Sie das Zellkulturmedium und Calcium Magnesium Kostenlose Medium (CMF) auf Raumtemperatur äquilibrieren. Sie müssen auch 0,1 er Marcs modifizierte Ringer-(MMR) pH 7,4-7,6. Sterilisieren die folgenden…

Representative Results

Beispiele von erfolgreich seziert Augenblasen (Stadium 25) und retinae (Stufe 35) sind in den Figuren 2E und 2J gezeigt. Während dieses Protokoll in verschiedenen Stadien der Entwicklung verwendet werden kann, ist es entscheidend, um nur Retinagewebe zu erhalten, um die Genauigkeit für weitere Experimente gewährleisten. Entfernen Sie vorsichtig die Epidermis in allen Phasen und sicherzustellen, dass Ihre Pinzette nicht Punktion der Netzhautgewebe. In der Stufe 35 oder älter, kann die Linse als klare…

Discussion

Mit seinen gut charakterisierten Zelltypen, die in allen Wirbeltieren konserviert sind, bietet die Netzhaut ein nützliches Modell für die Untersuchung der molekularen zellulären Prozesse, die die Zelltyp Spezifizierung und Differenzierung. Primäre Zellkultur bietet eine leistungsfähige Methode für die Untersuchung einer Vielzahl von Prozessen einschließlich Genexpression, Protein Dynamik und Kalzium und elektrische Aktivität auf der Ebene der einzelnen Zelle Auflösung. Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir huldvoll danken Dr. John Hayes für Skripte; Drs. Eric Bradley und Christopher Del Negro für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie, Drew Hughes, Laura Odorizzi, Alex Garafalo, Rebecca Lowden, und Liz MacMurray für ihre Arbeit bei der Entwicklung des Projekts und die Bereitstellung vorläufige Daten; Dr. Greg Smith für Anregungen auf einer statistischen Analyse. Diese Arbeit wurde durch ein NIH (NINDS IR15N5067566-01), um MSS und Howard Hughes Medical Institute Science Education Grant zum College of William and Mary unterstützt.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
For Dissections and Culturing
BD Falcon Easy Grip Tissue Culture Dishes, 35 mm Fisher 08-772A
Disposable Polystyrene Petri Dishes, 60 x 15 mm Fisher 0875713A
35 mm Nunclon Surface Petri Dishes (with Airvent) Fisher 12-565-91
Dumont Fine Forceps (Dumostar #55) Fisher NC9341917
Cellattice Micro-ruled plastic coverslip, 25 mm Fisher 50-313-17
Ethyl-m-Aminobenzoate Methanesulfonate Salt (MS-222) MP Biomedicals, LLC 103106
Gentamicin Sulfate Enzo Life Sciences 380-003-G025
Gibco Trypsin (1:250) Powder Life Technologies 27250-018
Collagenase B from Clostridium histolyticum Roche 11088831001
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
Nile Blue Sulfate (optional) Pfaltz & Bauer N05550
500 ml Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 μm Pore 33.2 cm2 CN Membrane Corning 430758
For Calcium Imaging
Fluo-4 AM 1 mM Solution in DMSO, Cell Permanent Life Technologies F-14217
Pluronic F-127 10% Solution in Water Life Technologies P-6866
LSM 510 Confocal Microscope System Zeiss Model Discontinued
Blocking Reagent Roche 11096176001
For Fluorescent in situ hybridization (FISH)
Anti-Digoxigenin-POD, Fab Fragments Roche 11207733910
Anti-DNP-HRP Antibody Perkin-Elmer NEL747A
Cy3 NHS ester GE Healthcare PA13101
NHS-Fluorescein Thermo Scientific 46409
Formamide, Deionized Amresco 0606-950ML
Torula RNA, Type IX Sigma-Aldrich R3629
Heparin Sodium Salt, from Porcine Intestinal Mucosa Sigma-Aldrich H3393-250KU
CHAPS Sigma-Aldrich C3023

Table 2. Specific reagents and equipment.
Solution Reference Contents
Cell Culture Medium Chang and Spitzer , 200954 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
2 mM CaCl2
1.31 mM MgSO4
4.6 mM Tris
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Calcium-Magnesium Free Medium (CMF) Gu et al., 199442; Gu and Spitzer, 199555 116 mM NaCl
0.67 mM KCl
4.6 mM Tris
0.4 mM EDTA
1 % (v:v) Penicillin/Streptomycin
Adjust pH to 7.8 with HCl.
Filter sterilize by passing through a 0.22 μm CN filter.
Store at 4 °C.
Maleic Acid Buffer (MAB) Sive et al., 200053 100 mM maleic acid
150 mM NaCl (pH 7.5).
Marc’s Modified Ringers (MMR), 10X Sive et al., 200053 100 mM NaCl
mM KCl
1 mM MgSO4
2 mM CaCl2
5 mM HEPES
pH adjusted to 7.4 with NaOH
0.1X MMR also contains 50 mg/ml gentamicin sulfate and pH is adjusted to 7.4 with NaOH.
MEMFA Solution, 10X Sive et al., 200053 0.1 M MOPS (Ph 7.4)
2 mM EGTA
1 mM MgSO4
3.7% formaldehyde
A 10X solution, without formaldehyde, can be stored at 4 °C. Formaldehyde is added fresh (1/10 volume of a standard 37% stock).
In situ Hybridization Buffer Sive et al., 200053 50% Formamide
5X SSC
1 mg/ml Torula RNA
100 mg/ml Heparin
1X Denhart’s Solution
0.1% Tween 20
0.1% CHAPS
10 mM EDTA.

Solutions. *Gentamicin, an antibiotic, is used in our MMR solutions while penicillin and streptomycin are used in our culture media.
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Referências

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McDonough, M. J., Allen, C. E., Ng-Sui-Hing, N. A., Rabe, B. A., Lewis, B. B., Saha, M. S. Dissection, Culture, and Analysis of Xenopus laevis Embryonic Retinal Tissue. J. Vis. Exp. (70), e4377, doi:10.3791/4377 (2012).
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