一个健壮的,小规模的HeLa细胞的核提取物制备的协议。该协议是为需要使用小种群的细胞,如细胞治疗药物或RNAi,有价值的实验。该方法应该适用于各种各样的基因表达分析和其他类型的细胞,包括病人的细胞。
在体外系统中使用已取得了很大的理解基因表达的进展。对于大多数的研究,功能分析进行了使用散装准备从10-50公升或悬浮细胞生长的提取物。然而,这些大规模的准备工作是不适合快速测试在体外作用,从各种细胞在体内的治疗方法或条件的结果。这日记视频文章显示准备功能的小规模的核提取物的方法,使用HeLa细胞作为一个例子。这种方法进行了用尽可能少3 150毫米作为附着单层细胞生长板。为了说明小规模提取物的效率,我们表明,他们是为大宗核提取物耦合RNA聚合酶II转录/剪接反应积极。为了证明提取协议的效用,我们表明,拼接准备从HeLa细胞提取物取消小号E7107拼接抑制剂药物治疗。小规模的协议应该是普遍适用于任何过程或细胞类型,可在体外用细胞提取物。这些措施包括病人的细胞,只有数量有限,或接触到众多的代理商,如毒品,DNA损伤剂,RNA干扰,或转,这就需要使用小细胞群的细胞。此外,少量的新鲜细胞生长的方便和/或某些应用程序所需的。
我们已经建立了一个快速和可重复性的方法编制HeLa细胞生长为单层少量的核提取物。我们表明,这些提取物显示,RNA聚合酶II转录/拼接实验的动力学和效率是在小规模和批量的核提取物类似的健壮。我们发现通过展示积极的转录,但在剪接缺陷,从与拼接抑制剂药物治疗的细胞准备提取物提取物的效用。
我们准备小规模的核提取物的方法,建立了结合和优化以前建立的方法从HeLa细胞提取物中悬浮生长在大尺度1,8和方法,为小规模提取物的制备9。我们建立了我们的协议,因为以前的小规模提取物,如一些分析功能耦合的转录/ SP,取得了较好检测。以前的小规模协议和我们之间的一个重要区别是,我们优化裂解细胞,使用一个小型的dounce的条件,而以前的协议裂解细胞,推他们通过一个小针头9。在泡沫的针裂解结果,这也许可以解释为什么提取物无效和/或难以重现一些分析。我们还增加了我们的协议浓度一步。这一步提高提取物的活动,这是极其敏感的浓度,也限制了提取物,是固有的小规模的筹备工作之间的变异。最后,我们准备定期开展与单层细胞只有三个150毫米板,批量提取物相比,没有任何活动的重要作用。因此,这个过程很容易适合小规模的准备,需要昂贵的试剂或细胞的可用性有限。例如,我们已经准备SMALL-RNAi技术敲除细胞和慢性淋巴细胞白血病(CLL)患者细胞中提取,用于这些提取物的功能和/或生化检测(EGF,JLH,TY和RR,未发表)。我们发现,提取有价值的RNAi由特定的生化检测,如immunopreciptations,西部片,银染,其次。建立一种特定的蛋白质击倒的疗效后,可以进行更详细的研究,通过稳定击倒细胞系,它可以用来准备额外的提取物,以较低的成本。质量法的蛋白质存在于这些击倒细胞株获得免疫,也将是一个有用的应用程序的方法。在小规模提取物除了再加转录/拼接法,我们为我们这里的协议描述的例子中使用,应该是普遍适用于众多的功能和生化检测,如那些用于不同的STEPS在基因表达(如封盖,剪接,转录,聚腺苷酸化,microRNA的加工)。该协议也可以适应病人的细胞类型可以得到悬浮(如白血病细胞)或(如病人的成纤维细胞)培养。最后,在手术过程中获得的细胞质部分需要细胞质的功能和生化检测证明非常有用。
The authors have nothing to disclose.
E. M. Winkelbauer的伤害,易卜拉欣P.瓦伦西亚,K.杜甫,郑H.有益的讨论,我们对此表示感谢。 HeLa细胞中获得了来自全国的细胞培养中心(明尼阿波利斯,明尼苏达州)。我们也感谢E7107和哈佛医学院的尼康影像中心提供帮助与光镜卫材有限公司。这项工作是由美国国立卫生研究院授予GM043375支持RR和EGF和NRSA金的JLH。
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.