Un protocole pour la préparation de solides, des extraits HeLa nucléaires à petite échelle est décrite. Ce protocole est valable pour les essais qui exigent l'utilisation de petites populations de cellules, telles que les cellules traitées avec des médicaments ou ARNi. La méthode devrait être applicable à une grande variété de tests d'expression génique et d'autres types cellulaires, y compris les cellules du patient.
Une grande partie des progrès réalisés dans l'expression des gènes compréhension a été faite en utilisant des systèmes in vitro. Pour la plupart des études, des analyses fonctionnelles sont réalisées en utilisant des extraits qui sont préparés en vrac à partir de 10-50 litres ou plus de cellules cultivées en suspension. Toutefois, ces préparations à grande échelle ne se prêtent pas à tester rapidement les effets in vitro qui résultent d'une variété de traitements cellulaires in vivo ou de conditions. Cet article journal vidéo montre un procédé de préparation fonctionnels petits extraits nucléaires, en utilisant des cellules HeLa comme un exemple. Cette méthode est réalisée à l'aide aussi peu que trois plaques de 150 mm de cellules cultivées sous forme de monocouches adhérentes. Pour illustrer l'efficacité des extraits à petite échelle, nous montrons qu'elles sont aussi actifs que des extraits nucléaires en vrac pour couplés ARN polymérase II de transcription / épissage réactions. Pour démontrer l'utilité du protocole extrait, nous montrons que l'épissage est abolie dans les extraits préparés à partir de cellules HeLas traités avec le médicament inhibiteur de l'épissage E7107. Le protocole à petite échelle devrait être d'application générale à tout processus ou type de cellule qui peut être étudié in vitro en utilisant des extraits cellulaires. Il s'agit notamment de cellules de patients qui ne sont disponibles en quantités limitées ou des cellules exposées à de nombreux agents tels que les médicaments, les agents endommageant l'ADN, ARNi, ou transfection, qui nécessitent l'utilisation de populations de cellules de petite taille. En outre, de petites quantités de cellules fraîchement cultivées sont pratiques et / ou nécessaire pour certaines applications.
Nous avons établi une méthode rapide et reproductible pour la préparation d'extraits nucléaires de petites quantités de cellules HeLa cultivées en monocouche. Nous avons démontré que ces extraits sont robustes, en montrant que la cinétique et de l'efficacité de ARNP II de transcription / épissage tests sont similaires dans les extraits à petite échelle et en vrac nucléaires. Nous avons montré l'utilité des extraits en démontrant que des extraits préparés à partir de cellules traitées avec un médicament inhibiteur de l'épissage sont actifs pour la transcription qui est défectueuse dans l'épissage.
Notre méthode pour la préparation de petits extraits nucléaires a été créée en combinant et en optimisant les méthodes précédemment établies pour en prendre des extraits de cellules HeLa cultivées en suspension à grande échelle 1,8 et une méthode pour la petite préparation d'extraits 9. Nous avons établi notre protocole parce que les précédentes petits extraits ne sont pas fonctionnels pour certains tests, tels que la transcription couplé / splicing dosage. Une différence importante entre l'ancienne petite échelle protocole 9 et le nôtre, c'est que nous avons optimisé les conditions de lyse des cellules en utilisant un mini-Dounce alors que le protocole précédent lysées cellules en les poussant à travers une aiguille de petit calibre 9. Les résultats d'aiguille de lyse dans des bulles, ce qui peut expliquer pourquoi les extraits étaient inactifs et / ou difficiles à reproduire pour certains dosages. Nous avons également ajouté une étape de concentration de notre protocole. Cette étape augmente l'activité des extraits, qui sont extrêmement sensibles à la concentration, et limite également la variabilité entre les extraits qui est inhérente aux petits préparatifs. Enfin, notre préparation est systématiquement réalisée avec seulement trois plaques de 150 mm de monocouches de cellules, sans effet significatif sur l'activité par rapport à des extraits en vrac. Ainsi, la procédure est susceptible d'être réduits pour les petits préparatifs qui nécessitent des réactifs coûteux ou de la disponibilité limitée des cellules. Par exemple, nous avons préparé small échelle des extraits de cellules knock-down RNAi et de chroniques des cellules de leucémie lymphoïde patients (CLL), et utilisé ces extraits pour les essais fonctionnels et / ou biochimiques (FEM, JLH, TY et RR, non publié). Nous avons constaté que les extraits sont précieux pour l'ARNi suivie par des dosages biochimiques spécifiques, tels que immunopreciptations, les westerns, et coloration à l'argent. Après avoir établi l'efficacité de renverser une protéine particulière, une étude plus détaillée peut être effectuée en faisant un effet de choc stable lignée cellulaire, qui peut être utilisé pour préparer des extraits supplémentaires à moindre coût. La spectrométrie de masse des protéines présentes dans immunoprécipités obtenu à partir de ces lignées de cellules knock-down sera également une application utile de la méthode. En plus de la transcription couplé / épissage test que nous avons utilisé comme exemple pour notre description du protocole ici, les extraits à petite échelle devraient être généralement applicable à de nombreux tests fonctionnels et biochimiques, tels que ceux utilisés pour la st différenteeps dans l'expression des gènes (par exemple le plafonnement, l'épissage, la transcription, la transformation microARN polyadénylation,). Le protocole peut également être adapté pour les types cellulaires de patients qui peuvent être obtenus soit en suspension (comme les cellules de LLC) ou cultivés dans la culture (telles que les fibroblastes des patients). Enfin, la fraction cytoplasmique obtenus au cours de la procédure devrait se révéler utile pour des analyses à la fois fonctionnelles et biochimiques qui nécessitent le cytoplasme.
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes reconnaissants à M. Winkelbauer-Hurt, E. Ibrahim, P. Valence, K. Dufu, H. Cheng pour des discussions utiles. Des cellules HeLa ont été obtenues de la National Culture Cellulaire Centre (Minneapolis, MN). Nous remercions également Eisai Co., Ltd pour fournir E7107 et le Nikon Imaging Center à Harvard Medical School de l'aide pour la microscopie optique. Ce travail a été soutenu par une subvention du NIH GM043375 à RR et de l'EGF et NRSA bourse pour JLH.
Name of the reagent | Full name of reagent | Company | Catalogue number |
HEPES | 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid | Sigma | H3375-500G |
MgCl2.6H2O | Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma | M2670-500G |
KCl | Potassium Chloride | Fisher | P335-212 |
PMSF | Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma | P7626-100G |
DTT | Dithiothreitol | American Bioanalytical | AB00490-5G |
EDTA | Ethylenediaminetetraacetate, disodium, dihydrate | American Bioanalytical | AB00500-01000 |
Glycerol | MP Biomedicals | 800689 | |
DMEM | Dulbecco’s Minimal Essential Medium | Invitrogen | 11995-073 |
FBS | Fetal Bovine Serum | Gibco | 16140 |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15070 | |
PBS | Phosphate Buffered Saline | Cellgro | 21-040-CV |
Trypan Blue Stain 0.4% | Gibco | 15250 | |
Cell Lifters | Corning | 29442-200 | |
150mm Plates | VWR | 353025 | |
Extended Micropipette Tip | Denville | P1126 | |
Dounce homogenizer, 1ml, with tight pestle | Wheaton | 357538 | |
Slidealyzers, MWCO 10kDa | ThermoScientific | 69572 | |
Mini-Centricons, MWCO 3kDa | Millipore (Amicon) | UFC500396 |
Table 1. Specific Reagents and Equipment.
Solution | Final | Stock | Dispense |
Hypotonic | 10 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 5 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 750 μl | |
10 mM KCl | 3M KCl | 1.67 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water | |||
Low Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
20 mM KCl | 3M KCl | 667 μl | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
High Salt | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 2 ml |
1.5 mM MgCl2 | 1M MgCl2 | 150 μl | |
1.4M KCl | 3M KCl | 48 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 40 μl | |
25% Glycerol | Glycerol | 25 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 100 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 25 μl | |
Bring up to 100 ml with water | |||
Dialysis | 20 mM HEPES, pH 7.9 | 1M HEPES, pH 7.9 | 10 ml |
100 mM KCl | 3M KCl | 16.625 ml | |
0.2 mM EDTA | 0.5M EDTA | 200 μl | |
20% Glycerol | Glycerol | 100 ml | |
0.2 mM PMSF | 200 mM PMSF | 500 μl | |
0.5 mM DTT | 2M DTT | 125 μl | |
Bring up to 500 ml with water |
Table 2. Solutions for Nuclear Extract Preparation.