La synthèse peptidique en phase solide efficace d'un peptide bis-fonctionnalisé trimère utilisant un "cran de sûreté" procédure de clivage de la résine HMBA est décrite.
En 1962, RB Merrifield a publié la première procédure en utilisant la synthèse peptidique en phase solide comme une nouvelle voie pour synthétiser efficacement des peptides. Cette technique s'est rapidement avéré avantageux par rapport à sa solution en phase prédécesseur dans le temps et le travail. Améliorations concernant la nature du soutien solide, les groupes protecteurs employés et les méthodes de couplage utilisées au cours des cinq dernières décennies n'ont fait qu'accroître l'utilité du système d'origine Merrifield. Aujourd'hui, l'utilisation d'une protection Boc-base et base / nucléophile stratégie de résine Fmoc-clivable ou une protection basée sur la stratégie de résine et acides clivable, mis au point par RC Sheppard, sont le plus couramment utilisé pour la synthèse de peptides 1.
Inspiré par Merrifield stratégie soutenue solide, nous avons développé une stratégie Boc / tert-butyle synthèse en phase solide pour l'assemblage des fonctionnalisés bis-2 peptides, qui est décrite ici. L'utilisation de synthèse en phase solide par rapport to solution en phase méthode n'est pas seulement avantageuse dans le temps et active telle que décrite par une Merrifield, mais permet également une plus grande facilité dans la synthèse de bis-peptidiques bibliothèques. La synthèse que nous démontrons ici intègre un stade clivage final qui utilise un en deux étapes "cran de sûreté" mécanisme pour libérer le bis-fonctionnalisé peptide de la résine par la formation de dicétopipérazine.
Bis-peptides sont rigides, des spiro-échelle oligomères de bis-acides aminés qui sont aptes à placer la fonctionnalité d'une manière prévisible et désignable, commandé par le type et la stéréochimie des unités monomères et de la connectivité entre chaque monomère. Chaque acide aminé est le bis-une stéréochimiquement pur, cyclique échafaudage qui contient deux acides aminés d'un acide carboxylique avec une α-aminé) 3,4. Notre laboratoire étudie actuellement le potentiel de bis-fonctionnels des peptides à travers une grande variété de domaines, y compris la catalyse, interactions protéine-protéine et nanomaterials.
L'approche de synthèse présenté ci fournit un procédé pour la synthèse de peptides fonctionnalisés bis-bis-aminés à partir des blocs de construction d'acide à l'aide communs en phase solide des techniques de synthèse des peptides. La synthèse du monomère de ces «blocs de construction" Pro4 de trans-4-hydroxyproline 3 est hautement évolutive et a été complété avec succès à la scène lors d'une hydantoïne mmol 600 (234 g) échelle (non publié). Une fois que les monomères sont dans la main, l'utilisation de techniques en phase solide fournit une méthode plus rapide de bis-peptide de synthèse que notre actuelle phase solution la méthodologie 4 en éliminant la nécessité d'une réaction de travail-ups et les purifications intermédiaires.
Le principal défi de synthèse en phase solide est le diagnostic des progrès synthétique et la résolution de problèmes étant donné qu'aucun des intermédiaires sont isolés. Ceci a conduit à la mise au point de nombreux tests colorimétriques y compris ceux de déterminer si des amines libres (Kaiser essai 10) ou sans hydroxydeYLS (rouge de méthyle essai 7) sont exposés sur la résine. Malheureusement, le test couramment utilisé Kaiser 10 n'est pas généralement applicable dans notre synthèse en phase solide en raison de l'utilisation presque exclusive des amines secondaires ou des amines attachés à un atome de carbone quaternaire. D'autres options pour l'évaluation de résine HMBA comprennent clivages de test en utilisant un nucléophile tel que l'hydrazine 11, quantitative clivage Fmoc surveillé par UV / Vis 1,11, et le piégeage et l'analyse des composés entrants activés.
Une autre question négligée dans synthèse en phase solide est le caractère répétitif des étapes de synthèse requises par l'opérateur. Avec cela à l'esprit, les auteurs recommandons fortement l'utilisation d'un tableur ou une liste lorsqu'il exerce une synthèse peptidique en phase solide manuel.
La difficulté dans l'utilisation de bis-peptides pour synthèse en phase solide par rapport à α communs acides aminés comprend le potentiel de plus difficile en raison de couplages stérique hinDrance, la nécessité pour les fermetures dicétopipérazines sur résine, et déprotections simultanées (BOC / tBu; Cbz / tBu). Une autre réside dans la réalisation difficilement libération quantitative de la résine à l'aide de cette "cran de sûreté" méthode par rapport à des moyens plus conventionnels. Avec ces facteurs à l'esprit, il est très possible que l'optimisation de ce procédé peut être réalisé et les efforts actuels sont en cours dans notre groupe pour améliorer la méthode présentée ici.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Zachary Z. Brown et Jennifer Alleva pour le développement initial de cette technique de synthèse en phase solide et Matthew Parker FL pour des discussions utiles. Ce travail est soutenu par la Defense Threat Reduction Agency (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) et le Horst Witzel Fellowship Award soutenu par Cephalon, Inc
Name | Company | Catalogue Number | Comments |
HMBA-Am Resin | NovaBiochem | 855018 | |
MSNT | NovaBiochem | 851011 | |
NMI | Sigma-Aldrich | 336092 | Toxic, Corrosive |
DCM | Sigma-Aldrich | D65100 | Carcinogenic |
Anhydrous DCM | Acros | 34846 | Carcinogenic |
33% Hydrogen Bromide in Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 248630 | Toxic, Corrosive, Fumes when open |
DIPEA | Sigma-Aldrich | 387649 | Flammable, Toxic, Corrosive |
DMF | Fisher Scientific | AC27960 | Flammable, Toxic |
Anhydrous DMF | Acros | 34843 | Flammable, Toxic |
HOAt | GenScript | C01568 | |
DIC | Acros | BP590 | Flammable, Toxic, Corrosive |
TFA | Sigma-Aldrich | T6508 | Toxic, Corrosive |
TIPS | Acros | 21492 | Flammable, Toxic |
Piperidine | Sigma-Aldrich | 104094 | Flammable, Toxic, Corrosive |
HATU | GenScript | C01566 | Toxic |
NMP | Acros | 36438 | Toxic |
DMAP | NovaBiochem | 851055 | Toxic |
Methyl Red | Sigma-Aldrich | 250198 | |
THF | Sigma-Aldrich | 401757 | Flammable, Toxic, Peroxide Forming |
Pyrrolidine | Sigma-Aldrich | P73803 | Flammable, Toxic, Corrosive |
Dimethyl Sulfoxide | Fisher | D1281 | |
SPPS Reaction Vessels | Grace | 211108 | |
LCMS | Agilent | 1200 Series | |
Semi-Prep LC | Hewlett Packard | 1100 Series | |
Lyophilizer | Labconco | 7934027 | |
Rotovapor | Buchi | R-210 Series | |
Argon | Airgas | AR PP300CT |