Summary

Préparation des tranches aiguës zone sous-ventriculaire pour l'imagerie calcique

Published: September 19, 2012
doi:

Summary

Une méthode pour charger des sous-ventriculaire (SVZ zone) des cellules avec des colorants indicateurs de calcium pour l'activité de calcium enregistrement est décrit. Le postnatale SVZ contient des cellules serrées y compris les cellules progénitrices neurales et neuroblastes. Plutôt que d'utiliser le chargement de bain nous avons injecté le colorant par la pression à l'intérieur du tissu permettant une meilleure diffusion du colorant.

Abstract

La zone sous-ventriculaire (SVZ) est l'une des deux zones neurogènes dans le cerveau postnatal. La SVZ contient des cellules très denses, y compris les cellules progénitrices neurales avec des caractéristiques astrocytaires (appelées astrocytes SVZ), neuroblastes, et les cellules progénitrices intermédiaires. Neuroblastes nés dans la SVZ tangentiellement migrer une grande distance vers le bulbe olfactif, où ils se différencient en interneurones. Signalisation intercellulaires par l'intermédiaire des molécules d'adhésion et de signaux diffusibles jouent un rôle important dans la neurogenèse contrôle. Beaucoup de ces signaux déclencher l'activité de calcium intracellulaire qui transmet l'information à l'intérieur et entre les cellules. L'activité de calcium est donc le reflet de l'activité des signaux extracellulaires et est un meilleur moyen de comprendre fonctionnelle signalisation intercellulaire entre les cellules SVZ.

L'activité de calcium a été étudiée dans de nombreuses autres régions et types de cellules, y compris les astrocytes et les neurones matures. Cependant, la méthode traditionnelle de loacellules d avec indicateur de calcium colorant (chargement de bain par exemple) n'était pas efficace pour le chargement de tous les types de cellules SVZ. En effet, la densité cellulaire dans la SVZ empêche la diffusion de colorant dans le tissu. En outre, la préparation de coupes sagittales sera mieux préserver l'agencement tridimensionnel de cellules, en particulier SVZ le flux de migration neuroblaste sur l'axe rostro-caudal.

Ici, nous décrivons les méthodes pour préparer des coupes sagittales contenant la SVZ, le chargement des cellules SVZ avec colorant indicateur de calcium, et de l'acquisition de l'activité de calcium avec time-lapse films. Nous avons utilisé Fluo-quatre heures colorant pour le chargement astrocytes SVZ l'aide de l'application de pression à l'intérieur du tissu. L'activité de calcium a été enregistrée à l'aide d'un microscope confocal à balayage permettant une résolution précise pour distinguer les cellules individuelles. Notre approche est applicable à d'autres zones neurogènes y compris la zone sous-granulaire de l'hippocampe et des adultes embryonnaires zones neurogènes. En outre, d'autres types de colorants peuventêtre appliqué en utilisant le procédé décrit.

Protocol

1. Préparation des solutions, Dissection, et Vibratome Les solutions doivent être préparées à l'osmolarité et le pH correct (tableau 1). Par rapport au liquide céphalo-rachidien artificiel (ACSF), la solution de dissection est préparé avec de faibles concentrations de sodium et de calcium, et de fortes concentrations de magnésium. Il s'agit de minimiser les effets excitotoxicité pendant le tranchage. Les deux solutions de dissection et ACSF doit être saturée ave…

Discussion

Imagerie calcique des cellules SVZ a été utilisé pour étudier les tendances de l'activité spontanée dans les neuroblastes 10, l'expression du récepteur de canal dans les deux neuroblastes et les astrocytes et des vagues de calcium 4,6,8 astrocytaires 3. Comme les cellules de la SVZ sont soit immatures ou ayant des propriétés gliales, ils ne se déclenche pas d'action potentiels 11,12, ce qui signifie que les changements dans milliseconde potentiel de tensi…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DC007681, AB), CT cellules souches subvention (AB), Pardee fondation (AB), Ruth L. prédoctorale Kirschstein national de recherches des bourses (NRSA) (SZY), et un NSF Graduate Research Fellowship (BL). Nous tenons à remercier les membres du laboratoire Bordey des commentaires utiles sur le manuscrit. Le matériel actuel est basé sur le travail soutenu en partie par l'État du Connecticut Connecticut sous la tige subventions Cellulaire Programme de recherche. Son contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les vues officielles de l'État du Connecticut, le ministère de la Santé publique de l'État du Connecticut CT ou des innovations, Incorporated.

Materials

Solute Company Catalog Number Dissection (mM)
Sucrose Sigma S0389 Dissection: 147 mM
ACSF: 0 mM
NaCl Sigma S9888 Dissection: 42 mM
ACSF: 126 mM
KCl Sigma P3911 Dissection: 2.5 mM
ACSF: 2.5 mM
MgCl2.6H2O Sigma M9272 Dissection: 4.33 mM
ACSF: 1 mM
NaH2PO4.H2O Sigma S8282 Dissection: 1.25 mM
ACSF: 1.25 mM
Glucose Sigma G8270 Dissection: 10 mM
ACSF: 10 mM
NaHCO3 Sigma S6014 Dissection: 26 mM
ACSF: 26 mM
CaCl2.2H2O Sigma C3306 Dissection: 1.33 mM
ACSF: 2 mM

Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.

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Name Company Catalogue Number Comments
Vibratome Leica VT 1000S  
Super Glue Surehold or 3M Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond  
Dissection tools Roboz or Ted Pella    
Fluo-4 AM calcium-sensitive dye Invitrogen F14201  
Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye Invitrogen O6807  
Pluronic F-127 20% solution in DMSO Invitrogen P3000MP  
Upright confocal microscope Olympus FV300 or FV1000  
Water-immersion objectives Olympus LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90)  
Micromanipulators Sutter MPC-200/MPC-325/MPC-385  
Pressure controller Parker Hannifin Picospritzer <3 PSI during application
Pipette puller Sutter or Narshige Sutter P-97 or Narshige PP-830  
Glass pipettes Sutter BF150-110-10 I.D.:1.10, O.D.: 1.50
Peristaltic pump Harvard Apparatus Model 720 flow rate: 1 ml/min
Chamber bath Warner Instruments RC-26 GLP Low profile allows for objective clearance
Tubing Tygon    
Temperature Controller Warner Instruments TC-324B/344B  

Table 2. Materials/equipment list.

Referências

  1. Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
  2. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
  3. Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
  4. Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
  5. Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
  6. Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
  7. Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
  8. Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
  9. Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
  10. Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
  11. Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
  12. Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
  13. Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
  14. Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
  15. Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).

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Citar este artigo
Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J., Bordey, A. Preparation of Acute Subventricular Zone Slices for Calcium Imaging. J. Vis. Exp. (67), e4071, doi:10.3791/4071 (2012).

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