칼슘 이미징에 대한 급성 Subventricular 지대 슬라이스의 작성
Summary
기록 칼슘 활동을위한 칼슘 표시기 염료와 subventricular 영역 (SVZ) 세포를로드 할 방법이 설명되어 있습니다. 출생 후의 SVZ는 신경 전구 세포와 neuroblasts 포함 단단히 포장 세포가 포함되어 있습니다. 오히려 목욕로드를 사용하는 것보다 우리가 더 나은 염료 확산을 허용 조직 내부의 압력에 의해 염료를 주입했다.
Abstract
subventricular 영역 (SVZ)는 출생 후의 뇌의 두 neurogenic 지역 중 하나입니다. SVZ는 astrocytic 기능 (SVZ의 astrocytes라고도 함), neuroblasts, 그리고 중간 전구 세포와 신경 전구 세포 등의 밀도가 높은 포장 세포가 포함되어 있습니다. SVZ에서 태어난 Neuroblasts는 tangentially가 interneurons로 차별화 후각 망울에 큰 거리를 마이그레이션. 접착 분자와 diffusible 신호를 통해 세포 신호는 제어 neurogenesis에 중요한 역할을 재생합니다. 이러한 신호의 대부분은 세포 내부와 사이에 정보를 전송 세포 칼슘 활동을 실행. 칼슘 활동은 세포 신호의 활동 따라서 반사하고 SVZ 세포 간의 기능적 세포 신호를 이해 할 수있는 최적의 방법입니다.
칼슘 활동이 성숙 astrocytes 뉴런 등 많은 다른 지역과 셀 유형,에서 공부하고 있습니다. 그러나, 로아에 전통적인 방법칼슘 표시기 염료 (예 : 욕조로드)와 D 세포는 모든 SVZ 세포 유형을로드에 효율적 아니 었습니다. 사실, SVZ의 세포 밀도는 조직 내부에 염료 확산을 precludes. 또한, 시상 조각을 준비하는 것은 더 나은 특히 SVZ 세포, 뱃 부리 장식이있는 – 꼬리 축에 neuroblast 이주의 흐름의 3 차원 배열을 유지합니다.
여기, 우리는 SVZ, 칼슘 표시기 염료와 SVZ 세포의 로딩, 시간 경과 영화와 칼슘 활동의 인수를 포함하는 시상 부분을 준비하는 방법을 설명합니다. 우리는 사용 Fluo-4는 조직 내부 압력 응용 프로그램을 사용하여 SVZ의 astrocytes를로드하는 염료입니다. 칼슘 활동이 구별 개별 셀에 대한 정확한 해결책을 허용 스캔 공 촛점 현미경을 사용하여 기록되었다. 우리 접근 방식은 성인 hippocampal subgranular 영역과 배아 neurogenic 구역 등 다른 neurogenic 영역에 적용됩니다. 또한, 염료 다른 유형의 수설명 방법을 사용하여 적용 할 수.
Protocol
Discussion
SVZ 세포의 칼슘 이미징은 neuroblasts 10 모두 neuroblasts 및 astrocytes 4,6,8 및 astrocytic 칼슘 웨이브 3 수용체 채널 표현의 자발적인 활동에 패턴을 공부하는 데 사용되었습니다. SVZ의 세포 중 유치 또는 glial 속성을 가지고 있기 때문에, 그들은 성숙 네트워크 활동을 나타내는 전압 잠재적으로 밀리 변경이 지역에서 적용되지 않습니다 즉, 행동 할 가능성 11,12를 해고하지 ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (DC007681, AB), CT 줄기 세포 기금 (AB), Pardee 재단 (AB), Predoctoral 루스 L. Kirschstein 국가 연구 서비스 상 (NRSA) (SZY) 및 NSF 대학원 연구에서 보조금에 의해 지원되었다 휄로 십 (BL). 우리는 원고에 대한 유용한 의견을 Bordey 실험실 구성원을 감사드립니다. 현재 자료는 부분적으로 코네티컷의 줄기 세포 연구 보조금 프로그램의 코네티컷 주에서 지원 작업에 기반을두고 있습니다. 의 내용이 전적으로 저자의 책임이며 반드시 코네티컷 주의 공식 전망을 대변하지 않습니다, 코네티컷 또는 중부 표준시 혁신의 주 공중 보건학과가 통합되었습니다.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
Referências
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