कैल्शियम इमेजिंग के लिए तीव्र subventricular क्षेत्र स्लाइस की तैयारी
Summary
Subventricular क्षेत्र कोशिकाओं (SVZ) रिकॉर्डिंग कैल्शियम गतिविधि के लिए कैल्शियम सूचक रंगों के साथ लोड करने के लिए एक विधि का वर्णन है. प्रसवोत्तर SVZ तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं और neuroblasts कसकर बांध सहित सेल शामिल हैं. लोड हो रहा है स्नान का उपयोग करने के बजाय हम बेहतर डाई प्रसार की अनुमति के ऊतकों के अंदर दबाव से डाई इंजेक्शन.
Abstract
subventricular क्षेत्र (SVZ) प्रसव के बाद मस्तिष्क में दो तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों में से एक है. SVZ astrocytic (SVZ astrocytes कहा जाता है), neuroblasts, और मध्यवर्ती पूर्वपुस्र्ष कोशिकाओं के साथ तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं सहित कोशिकाओं घनी पैक शामिल हैं. SVZ में पैदा हुआ Neuroblasts tangentially घ्राण बल्ब, जहां वे interneurons में अंतर करने के लिए एक महान दूरी विस्थापित. आसंजन अणु और प्रसारण संकेतों के माध्यम से कहनेवाला संकेतन को नियंत्रित करने neurogenesis में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. इन संकेतों के कई कहनेवाला कैल्शियम गतिविधि है कि अंदर और कोशिकाओं के बीच में जानकारी पहुंचाता ट्रिगर. कैल्शियम गतिविधि कोशिकी संकेतों की गतिविधि के इस प्रकार से प्रतिबिंबित करता है और SVZ कोशिकाओं के बीच कार्यात्मक कहनेवाला संकेत समझने के लिए एक इष्टतम तरीका है.
कैल्शियम गतिविधि कई अन्य क्षेत्रों और परिपक्व astrocytes और न्यूरॉन्स सहित सेल प्रकार में अध्ययन किया गया है. हालांकि, loa पारंपरिक विधिकैल्शियम सूचक डाई (यानी स्नान लोड हो रहा है) के साथ कोशिकाओं के सभी SVZ सेल प्रकार लोड करने में सक्षम नहीं था. दरअसल, SVZ में सेलुलर घनत्व ऊतक के अंदर डाई प्रसार precludes. इसके अलावा, बाण के समान स्लाइस की तैयारी बेहतर SVZ कोशिकाओं, विशेष रूप से व्याख्यान चबूतरे वाला – दुम का अक्ष पर neuroblast प्रवास के धारा के तीन आयामी व्यवस्था की रक्षा करेंगे.
यहाँ, हम बाण के समान वर्गों SVZ, कैल्शियम सूचक डाई साथ SVZ कोशिकाओं के लोड हो रहा है, और समय चूक फिल्मों के साथ कैल्शियम गतिविधि के अधिग्रहण युक्त तैयार करने की विधियों का वर्णन. हम प्रयोग किया जाता Fluo-4 SVZ ऊतक के अंदर दबाव आवेदन का उपयोग astrocytes लोड करने के लिए डाई AM. कैल्शियम गतिविधि एक स्कैनिंग confocal विशिष्ठ व्यक्ति की कोशिकाओं के लिए एक सटीक संकल्प की अनुमति माइक्रोस्कोप का उपयोग कर दर्ज की गई थी. हमारा दृष्टिकोण वयस्क hippocampal subgranular क्षेत्र और भ्रूण तंत्रिकाजन्य क्षेत्र सहित अन्य तंत्रिकाजन्य क्षेत्रों के लिए लागू है. इसके अलावा, रंगों के अन्य प्रकार के कर सकते हैंवर्णित विधि का उपयोग कर लागू होता है.
Protocol
Discussion
SVZ कोशिकाओं के कैल्शियम इमेजिंग 10 neuroblasts, रिसेप्टर दोनों neuroblasts और astrocytes 4,6,8 और astrocytic कैल्शियम 3 लहरों में चैनल की अभिव्यक्ति में सहज गतिविधि में पैटर्न का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. चूं?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम NIH (DC007681, एबी), सीटी स्टेम सेल अनुदान (एबी), Pardee नींव (एबी), predoctoral रूथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा (एनआरएसए) पुरस्कार (SZY), और एक NSF स्नातकोत्तर अनुसंधान से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया फैलोशिप (बीएल). हम पांडुलिपि पर उपयोगी टिप्पणी के लिए Bordey प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं. वर्तमान सामग्री आंशिक रूप से कनेक्टिकट स्टेम सेल अनुसंधान अनुदान कार्यक्रम के तहत कनेक्टिकट के राज्य द्वारा समर्थित काम पर आधारित है. इसकी सामग्री केवल लेखकों की ज़िम्मेदारी है और कनेक्टिकट के राज्य के अधिकारी विचार जरूरी नहीं प्रतिनिधित्व, कनेक्टिकट या सीटी नवाचार राज्य के सार्वजनिक स्वास्थ्य के विभाग, शामिल है.
Materials
| Solute | Company | Catalog Number | Dissection (mM) |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Dissection: 147 mM ACSF: 0 mM |
| NaCl | Sigma | S9888 | Dissection: 42 mM ACSF: 126 mM |
| KCl | Sigma | P3911 | Dissection: 2.5 mM ACSF: 2.5 mM |
| MgCl2.6H2O | Sigma | M9272 | Dissection: 4.33 mM ACSF: 1 mM |
| NaH2PO4.H2O | Sigma | S8282 | Dissection: 1.25 mM ACSF: 1.25 mM |
| Glucose | Sigma | G8270 | Dissection: 10 mM ACSF: 10 mM |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | Dissection: 26 mM ACSF: 26 mM |
| CaCl2.2H2O | Sigma | C3306 | Dissection: 1.33 mM ACSF: 2 mM |
Table 1. Chemical list and recipes of dissection solution and ACSF.
| [header] | |||
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
| Vibratome | Leica | VT 1000S | |
| Super Glue | Surehold or 3M | Surehold 3G Super Glue or 3M Vet-Bond | |
| Dissection tools | Roboz or Ted Pella | ||
| Fluo-4 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | F14201 | |
| Oregon Green BAPTA-1 AM calcium-sensitive dye | Invitrogen | O6807 | |
| Pluronic F-127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Upright confocal microscope | Olympus | FV300 or FV1000 | |
| Water-immersion objectives | Olympus | LUMPlanFl 40 x W/IR (NA 0.80); LUMPlanFl 60 x W/I (NA 0.90) | |
| Micromanipulators | Sutter | MPC-200/MPC-325/MPC-385 | |
| Pressure controller | Parker Hannifin | Picospritzer | <3 PSI during application |
| Pipette puller | Sutter or Narshige | Sutter P-97 or Narshige PP-830 | |
| Glass pipettes | Sutter | BF150-110-10 | I.D.:1.10, O.D.: 1.50 |
| Peristaltic pump | Harvard Apparatus | Model 720 | flow rate: 1 ml/min |
| Chamber bath | Warner Instruments | RC-26 GLP | Low profile allows for objective clearance |
| Tubing | Tygon | ||
| Temperature Controller | Warner Instruments | TC-324B/344B |
Table 2. Materials/equipment list.
Referências
- Peretto, P., Giachino, C., Aimar, P., Fasolo, A., Bonfanti, L. Chain formation and glial tube assembly in the shift from neonatal to adult subventricular zone of the rodent forebrain. J. Comp Neurol. 487, 407-427 (2005).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Imaging and recording subventricular zone progenitor cells in live tissue of postnatal mice. Front. Neurosci. 4, 10-3389 (2010).
- Lacar, B., Young, S. Z., Platel, J. C., Bordey, A. Gap junction-mediated calcium waves define communication networks among murine postnatal neural progenitor cells. Eur. J. Neurosci. , (2011).
- Platel, J. C., Dave, K. A., Gordon, V., Lacar, B., Rubio, M. E., Bordey, A. NMDA receptors activated by subventricular zone astrocytic glutamate are critical for neuroblast survival prior to entering a synaptic network. Neuron. 65, 859-872 (2010).
- Platel, J. C., Dupuis, A., Boisseau, S., Villaz, M., Albrieux, M., Brocard, J. Synchrony of spontaneous calcium activity in mouse neocortex before synaptogenesis. Eur. J. Neurosci. 25, 920-928 (2007).
- Young, S. Z., Platel, J. C., Nielsen, J. V., Jensen, N. A., Bordey, A. GABAA increases calcium in subventricular zone astrocyte-like cells through L- and T-type voltage-gated calcium channels. Front. Cell. Neurosci. 4, 8 (2010).
- Bolteus, A. J., Bordey, A. GABA Release and Uptake Regulate Neuronal Precursor Migration in the Postnatal Subventricular Zone. J. Neurosci. 24, 7623-7631 (2004).
- Platel, J., Heintz, T., Young, S., Gordon, V., Bordey, A. Tonic activation of GLUK5 kainate receptors decreases neuroblast migration in a whole mount preparation of the subventricular zone. J. Physiol. (Lond). 586, 3783-3793 (2008).
- Nam, S. C., Kim, Y., Dryanovski, D., Walker, A., Goings, G., Woolfrey, K., Kang, S. S., Chu, C., Chenn, A., Erdelyi, F., Szabo, G., Hockberger, P., Szele, F. G. Dynamic features of postnatal subventricular zone cell motility: a two-photon time-lapse study. J. Comp. Neurol. 505, 190-208 (2007).
- Lacar, B. L., Platel, J. C., Bordey, A. GABA controls Ca2+ activity-dependent network synchrony in the adult neurogenic forebrain. , (2007).
- Liu, X., Bolteus, A. J., Balkin, D. M., Henschel, O., Bordey, A. GFAP-expressing cells in the postnatal subventricular zone display a unique glial phenotype intermediate between radial glia and astrocytes. Glia. 54, 394-410 (2006).
- Wang, D. D., Krueger, D. D., Bordey, A. Biophysical properties and ionic signature of neuronal progenitors of the postnatal subventricular zone in situ. J. Neurophysiol. 90, 2291-2302 (2003).
- Tian, L., Hires, S. A., Mao, T., Huber, D., Chiappe, M. E., Chalasani, S. H., Petreanu, L., Akerboom, J., McKinney, S. A., Schreiter, E. R., Bargmann, C. I., Jayaraman, V., Svoboda, K., Looger, L. L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6, 875-881 (2009).
- Zhao, Y., Araki, S., Wu, J., Teramoto, T., Chang, Y. F. An expanded palette of genetically encoded Ca(2) indicators. Science. 333, 1888-1891 (2011).
- Shigetomi, E., Kracun, S., Sofroniew, M. V., Khakh, B. S. A genetically targeted optical sensor to monitor calcium signals in astrocyte processes. Nat. Neurosci. 13, 759-766 (2010).
