Questo metodo descrive come isolare e immortalare cellule endoteliali microvascolari di cervello di topo. Descriviamo un passo-passo protocollo partire dalla omogeneizzazione del tessuto cerebrale, mineralizzazione, semina e immortalizzazione delle cellule. Di solito, ci vogliono circa cinque settimane per ottenere una omogenea, immortalato linea microvascolare delle cellule endoteliali.
Cellule epiteliali ed endoteliali (EC) sono paracellulare costruzione di barriere che proteggono il tessuto dall'ambiente esterno e interno. La barriera emato-encefalica (BBB), composto da CE, astrociti finali piedi, periciti e la membrana basale è responsabile per la protezione e l'omeostasi del parenchima cerebrale. Modelli in vitro BBB sono strumenti comuni per studiare la struttura e la funzione del BBB a livello cellulare. Un numero considerevole di diversi modelli in vitro BBB sono stati stabiliti per la ricerca in laboratori diversi fino ad oggi. Solitamente, le cellule sono ottenute da bovini, suini, cervello di ratto o topo tessuto (discusso in dettaglio nella rassegna di Wilhelm et al. 1). Campioni di tessuti umani sono disponibili solo in un numero limitato di laboratori o società 2,3. Mentre preparazioni di cellule primarie sono in termini di tempo e le culture della CE può variare da lotto a lotto, la creazione di immortalato CE lines è al centro di interesse scientifico.
Qui vi presentiamo un metodo per stabilire una linea immortalato cervello microvascolare CE, dal cervello di topo neonatale. Descriviamo il passo-passo la procedura profilo reagenti e le soluzioni utilizzati. Il metodo stabilito dal nostro laboratorio permette l'isolamento di una linea omogenea immortalato cellule endoteliali entro quattro o cinque settimane. Le linee di cellule microvascolari cerebrali endoteliali definito CEND 4 (da corteccia cerebrale) e cerebEND 5 (da corteccia cerebellare), sono stati isolati secondo questa procedura in laboratorio Förster e sono state effettivamente utilizzate per la spiegazione dei diversi processi fisiologici e patologici a BBB. Utilizzando CEND e cerebEND abbiamo dimostrato che queste cellule rispondono a glucocorticoidi 4,6-9 ed estrogeno-trattamento 10 nonché a pro-infammatory mediatori, come TNFalfa 5,8. Inoltre, abbiamo studiato la patologia multiple sclerosis 11 e ipossia 12,13 sul CE-livello. Il CEND e linee cerebEND può essere considerata un valido strumento per studiare la struttura e la funzione delle risposte, BBB cellulari di EC per diversi stimoli o interazione del CE con linfociti o cellule tumorali.
La procedura descritta può essere utilizzato per l'isolamento di microvascolare ECS di diversi ceppi di topi nonché da diversi knock-out ceppi di topo per studiare le variazioni specifiche funzione vascolare. Come metodo di immortalizzazione abbiamo utilizzato la trasformazione con oncoproteina di poliomavirus murino, Polyoma mezzo antigene T. Si trasforma rapidamente immature cellule endoteliali in vivo e in vitro 20,21,22. Altri metodi di immortalizzazione di ECs descritti in letteratura includono per esempio l'immortalizzazione con SV40 antigene T grande di Simian Virus vacuolizzante 40 23, prodotto genico adenovirus E1A 24 o sovraespressione della subunità catalitica della telomerasi umana 3. L'immortalizzazione con PymT è specifico per il murina EC immaturo, che consente di ottenere una cultura omogenea CE da topi neonati in breve tempo. Immortalizzazione modifica le proprietà delle cellule e THrisultati ottenuti elettroniche con linee cellulari immortalizzate devono essere confrontati sia con cellule primarie o con esperimenti in vivo con topi. PymT immortalato CE è stato descritto per esprimere elevati livelli di attività fibrinolitica risultanti dalla produzione aumentata di urochinasi, attivatore del plasminogeno di tipo e diminuita produzione di plasminogeno inibitori 25. Confronto diretto PymT immortalato bEND5 linea cellulare con primario EC rivelato che sia in vitro modelli BBB sono adatti per studi di adesione cellulare T 26.
Le linee cellulari stabilite secondo la procedura descritta può essere utilizzata al numero passaggio basso per mantenere le proprietà di barriera per l'espressione di proteine BBB e CE giunzionali, come cellule perdono queste proprietà durante l'invecchiamento. Così dopo la perdita di proprietà barriera, la preparazione di una nuova linea cellulare dovrebbe essere considerato. Placcatura densità delle cellule dovrebbe essere alto per EC, in quanto questo è un fattore critico per la proliferazione cellulare. Questo deve essere considerato nel corso della procedura di isolamento, nonché il mantenimento della immortalato EC. Ogni linea cellulare dovrebbe essere testato per le sue proprietà di barriera e di eventuali contaminanti con altri tipi cellulari. Monostrati CE può essere trattata con l'antigene muscolare anti-galactocerebroside, anti-proteina acidica fibrillare gliale e anti-liscia come anticorpi primari per escludere la contaminazione con gli oligodendrociti, astrociti e periciti 4,27. Per escludere la contaminazione da vascolatura meningal, l'espressione di trombomodulina può essere testata, che è espresso in tutti i letti vascolari con l'eccezione del cervello 28.
È interessante notare che le linee cellulari immortalizzate microvascolari endoteliali isolate da differenti regioni del cervello si differenziano per le loro proprietà di barriera e la suscettibilità a stimoli pro-infiammatori. Come esempio, i CEND cerebrale e cerebellare linee cellulari cerebEND possono citare 4,5. CerebEND mostrato, in confrontoa CEND, più bassi livelli di espressione delle principali componenti di giunzione strette claudina-1 e occludina. Tuttavia, i livelli di claudina-3 e -12 erano più elevati nei cerebEND. La funzione di barriera di cellule cerebEND sofferto molto più sotto un trattamento con il mediatore infiammatorio, TNFa che le proprietà di barriera di cellule CEND fatto 5. Maggiore vulnerabilità cerebellare a stimoli infiammatori, può essere osservato in vivo in pazienti con sclerosi multipla e nel suo modello sperimentale animale di encefalomielite autoimmune 29. Questi risultati interessanti mostrano la necessità di generare e caratterizzare individuale modelli in vitro per diverse regioni del cervello, per migliorare il farmaco futuro mira nel cervello.
The authors have nothing to disclose.
Questa ricerca è stata sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG con il numero di sovvenzione FO 315/4-1 e DFG SFB 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |