Summary
हम प्रदर्शन कैसे intracellular कैल्शियम एकाग्रता और synaptic प्रभावकारिता में परिवर्तन के साथ ही एक नाड़ीग्रन्थि की तैयारी में नजर रखी जा सकती है
Protocol
1. तैयारी
- 75-100 मिलीग्राम isotonic मैग्नीशियम क्लोराइड समाधान इंजेक्शन द्वारा पशु anesthetize. Aplysia हम इमेजिंग के लिए उपयोग आम तौर पर 150-200 ग्राम और Marinus वैज्ञानिक से प्राप्त कर रहे हैं.
- एक कवर मोम पकवान anesthetized पशु पिन. सिरिंज सुई इस उद्देश्य के लिए अच्छी तरह से काम करते हैं, बाँझ तकनीक आवश्यक नहीं हैं. सकल संदंश और मानक कैंची का उपयोग पशु पैर में एक चीरा बनाने और मुख जन बेनकाब. मुख नाड़ीग्रन्थि पता लगाएँ. वसंत कैंची और ठीक संदंश का प्रयोग, ध्यान से मुक्त सभी मुख नसों में कटौती करके नाड़ीग्रन्थि.
- नाड़ीग्रन्थि निकालें और यह एक Sylgard लेपित कृत्रिम समुद्री जल से युक्त पकवान में जगह. मुख नसों के माध्यम से एक कुछ कीट पिन प्लेस नाड़ीग्रन्थि स्थिर. Desheath मुख intracellular रिकॉर्डिंग के लिए न्यूरॉन्स को बेनकाब नाड़ीग्रन्थि ultrafine संदंश और वसंत कैंची, इतनी के रूप में उपयोग कर. फिर 15 के बारे में ठीक (कीट नाड़ीग्रन्थि फिर से पिन मिनटutien पिन). नाड़ीग्रन्थि जगह में मजबूती से आयोजित किया जाना चाहिए के रूप में किसी भी आंदोलन इमेजिंग दौरान समस्याग्रस्त हो जाएगा.
2. इलेक्ट्रोड तैयार करें
- रेशा के साथ कांच केशिका टयूबिंग का उपयोग इलेक्ट्रोड (जैसे डब्ल्यूपीआई TW100F-4) और एक डांड़ी खींचो. सेटिंग्स व्यक्तिगत रूप से आवश्यक प्रतिरोध के इलेक्ट्रोड बनाने के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए. जब एम 3 KAC के साथ भरा (पोटेशियम एसीटेट) हमारे इलेक्ट्रोड प्रतिरोध के बारे में आम तौर पर 10 MOhms है अगर इलेक्ट्रोड beveled, या 5 MOhms के बारे में अगर beveling कदम छोड़ दिया जाता है.
- 3 एम KAc/30 मिमी एक सिरिंज और MICROFIL सुई का उपयोग KCl युक्त समाधान के साथ इलेक्ट्रोड का एक सेट भरें. ये इलेक्ट्रोड इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी के लिए इस्तेमाल किया जाएगा.
- डाई में इलेक्ट्रोड के पीछे के अंत सूई से कैल्शियम सूचक डाई के साथ इलेक्ट्रोड की एक दूसरे सेट भरें, पहले लगभग साथ पुनर्गठन. 500μg डाई के लिए 40 μl आसुत जल. जब इलेक्ट्रोड की नोक भर दी गई है, के बारे में 1/4 इंच भर200 KCl मिमी अच्छा विद्युत संपर्क सुनिश्चित करने के साथ इलेक्ट्रोड के अंत.
- यह इलेक्ट्रोड बेवल के लिए फायदेमंद है, के रूप में इस डाई इंजेक्शन की सुविधा और कई झिल्ली पेनेट्रेशन द्वारा किया क्षति को कम कर देता है. हम एक कस्टम beveler कि एक नमक पाउडर / पानी एल्यूमिना निलंबन की एक धारा उत्पन्न का उपयोग करें. इलेक्ट्रोड एक धारक में रखा है और अपने टिप एक 45 डिग्री कोण पर धारा में प्रवेश करती है. इलेक्ट्रोड प्रतिरोध लगातार नजर रखी है और beveling समाप्त जब KAC भरा इलेक्ट्रोड के लिए प्रतिरोध के बारे में 5 MOhm पहुंचता है. डाई भरा इलेक्ट्रोड समय की एक समान राशि के लिए beveled कर रहे हैं और आम तौर पर 15-20 MOhm की resistances है.
3. कैल्शियम संकेतक डाई लोड हो रहा है
- एक इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिग पर तैयार रखें और नेत्रहीन ब्याज की प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन का पता लगाने. हमारे प्रयोगों में से कई एक की पहचान संवेदी न्यूरॉन खिला, B21 5, 6 के दौरान उपयोग के साथ किया जाता है. अपेक्षाकृत तय पदोंn, आकार (~ 100 सुक्ष्ममापी), और B21 सोमा के लम्बी आकार इसे आसानी से ढूँढ बनाते हैं.
- एक इलेक्ट्रोड युक्त कैल्शियम सूचक डाई के साथ ब्याज की न्यूरॉन कोचना. B21 पहचान बाद synaptic न्यूरॉन B8 impaling द्वारा सत्यापित किया जा सकता है. B21 ~ 8 ना वर्तमान के साथ विध्रुवण spikes और 7 B8 में PSPs को सुविधाजनक बनाने में परिणाम ट्रिगर किया जाएगा.
- ब्याज की प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन में लगभग 30 मिनट के लिए hyperpolarizing दालों (आमतौर पर -15 एनए, 1 हर्ट्ज, 75% कर्तव्य चक्र) से गुजर रहा डाई इंजेक्षन. यदि डाई लोड हो रहा है सफल है, न्यूरॉन सोमा एक बेहोश गुलाबी रंग का अधिग्रहण करेगी. न्यूरॉन से धीरे धीरे इसे वापस इलेक्ट्रोड डाई युक्त निकालें.
- लगभग 30 मिनट के लिए तैयारी छोड़ डाई ठीक प्रक्रियाओं है कि अनुयायी न्यूरॉन्स के साथ synaptic संपर्क बनाने में विसरित करने की अनुमति है.
4. कैल्शियम इमेजिंग और electrophysiological रिकॉर्डिंग
- इमेजिंग microsc पर तैयारी रखेंope. तैयारी के साथ पकवान Permagum सील की हड्डी के टुकड़े के साथ एक ठंडा मंच है, जो मिट्टी के विपरीत, जब गीला चिपचिपा रहता है पर आयोजित किया जाता है. निश्चित मंच खुर्दबीन उद्देश्य हिल द्वारा केंद्रित है. मंच स्थिर रहता है, जो चुंबक घुड़सवार manipulators संलग्न की अनुमति देता है. उच्च वृद्धि के रूप में कंपन (विशेष रूप से पार्श्व आंदोलन) एक समस्या बनाता है, पूरे इमेजिंग सेटअप एक कंपन अलगाव मंच पर रखा जाना चाहिए.
- Presynaptic और postsynaptic न्यूरॉन्स सामान्य इलेक्ट्रोलाइट समाधान युक्त इलेक्ट्रोड के साथ कोचना.
- एक फिल्टर छवि कैल्शियम ऑरेंज के लिए उपयुक्त खंड (549 एनएम उत्तेजना, उत्सर्जन 576 एनएम) 8 का चयन करें और कैमरे को समायोजित. अधिकांश वैज्ञानिक सीसीडी कैमरों अन्वेषक सीसीडी कोशिकाओं है कि बाहर पढ़ रहे हैं की एक सबसेट का चयन करने के लिए अनुमति देते हैं. इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं (binned) जोड़ा जा सकता है. एक छोटे सबसेट बढ़ जाती है गति का चयन, जबकि binning बढ़ संवेदनशीलता. इन दो सेटिंग, जोखिम समय के साथ मिलकर यह निर्धारित करने के लिए,फ्रेम दर यानी कितने छवियाँ प्रति सेकंड हासिल किया जा सकता है. उपयुक्त सेटिंग्स छवि 500 x 300 पिक्सल (एक 10x लेंस और एक 0.5x कैमरा एडाप्टर का उपयोग) के साथ 580 x 350 2 मीटर के एक क्षेत्र होगा. प्रकाश पथ तटस्थ घनत्व फिल्टर जोड़ें न्यूनतम राशि है कि एक जोखिम समय <25 एमएस के साथ सही प्रदर्शन प्रदान करने के लिए रोशनी की तीव्रता को समायोजित. इन सेटिंग्स के बारे में 30 हर्ट्ज के एक फ्रेम दर में परिणाम चाहिए जो Aplysia में तेजी छवि एकल कैल्शियम परिवर्तन पैदा कील करने के लिए पर्याप्त है. अंत में, ताकि केवल imaged क्षेत्र प्रबुद्ध है क्षेत्र एपर्चर बंद.
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर में न्यूरॉन क्षेत्रों आप के लिए उपाय करना चाहते हैं निशान. तत्वों एआर सॉफ्टवेयर में इस "समय मापन" खंड में ब्याज के क्षेत्रों (ROIs) रखने के द्वारा किया जाता है. B21 एक द्विध्रुवी न्यूरॉन है और पिछले काम दिखा दिया है कि अपने पार्श्व प्रक्रिया संपर्क 9 हित के postsynaptic न्यूरॉन. हम आम तौर पर छवि प्राथमिक, द्वितीयक और तृतीयक ब्रापार्श्व प्रक्रिया के न्यूरॉन के प्रत्येक भाग में एक रॉय रखने nches. एक अतिरिक्त डाई भरा न्यूरॉन को अगले रॉय एक पृष्ठभूमि मूल्य है कि बाद में अन्य सभी डेटा बिंदुओं से घटाया जाता है प्रदान करने के लिए मापा जाता है.
- आज्ञा इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी (इन प्रयोगों स्पाइक द्वितीय) में अधिग्रहण करने के लिए कैमरे के फ्रेम readout संकेत द्वारा उपलब्ध कराई गई एक ट्रिगर संकेत के लिए इंतजार. छवि अधिग्रहण (तत्वों एआर) प्रारंभ, स्पाइक द्वितीय अब स्वचालित रूप से रिकॉर्डिंग शुरू होगा जब कैमरा अपनी पहली फ्रेम लेता है. तुम भी 1401 पावर के एक टीटीएल उत्पादन का उपयोग करने के लिए संक्षेप में एक माइक्रोस्कोप कैमरा बंदरगाह में घुड़सवार एलईडी पर बारी कर सकते हैं. यह एक संकेत के बाद इमेजिंग और electrophysiological डेटा सिंक्रनाइज़ प्रदान करेगा.
- प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन वांछित आवृत्ति पर संक्षिप्त depolarizing वर्तमान दालों की एक श्रृंखला इंजेक्शन द्वारा उत्तेजित. यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक नाड़ी की निगरानी (ट्रिगर आस्टसीलस्कप प्रोत्साहन के साथ उदाहरण के लिए) के लिए तय है कि एक कार्रवाई संभावित सफलully उत्पन्न. जबकि कैल्शियम ऑरेंज अन्य रंगों की तुलना में बहुत फोटो स्थिर है, यह एक अच्छा विचार है उत्तेजना के बिना एक नियंत्रण परीक्षण रिकॉर्ड की जांच कितना होता है विरंजन डाई.
- प्रयोगों में जो intracellular कैल्शियम की सांद्रता में हेरफेर कर रहे हैं, EGTA रूप में एक दवा प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन में पेश किया जाता है और उत्तेजना और डाटा अधिग्रहण ऊपर वर्णित चरणों दोहराया जाता है.
5. प्रतिनिधि डेटा का विश्लेषण
- यह एक पाठ फ़ाइल में लिखने के द्वारा निर्यात इमेजिंग डेटा (प्रत्येक रॉय के लिए मापा तीव्रता मूल्यों की सूची). स्पाइक द्वितीय में एक कस्टम स्क्रिप्ट तो पाठ फ़ाइल आयात कर सकते हैं. इस स्क्रिप्ट भी व्यक्ति जांच के क्षेत्र के साथ मूल्यों normalizes, और पृष्ठभूमि की जांच के मूल्य को घटा देती है. डेटा बिंदुओं तो एक "आभासी RealWave" चैनल के रूप में इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी डेटा के साथ साजिश रची है. स्पाइक द्वितीय में "प्रक्रिया / समय पाली समारोह चैनल" ठीक इमेजिंग डेटा poi प्रयोग के लिए पंक्ति हैएनटीएस, संदर्भ के रूप में एलईडी संकेत का उपयोग कर.
- प्रतिशत परिवर्तन के रूप में मूल्यों को प्राप्त करने के लिए, DF प्रतिदीप्ति में रिश्तेदार परिवर्तन की गणना इमेजिंग डेटा का विश्लेषण / एफ ओ = एफएफ (ओ) / एफ ओ. एफ ओ प्रेरणा और प्रोत्साहन के दौरान प्रतिदीप्ति एफ से पहले प्रतिदीप्ति स्तर को दर्शाता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1 प्रयोग की समग्र योजना. प्रयोगों Aplysia की एक नाड़ीग्रन्थि तैयारी में आयोजित की जाती हैं. Intracellular कैल्शियम में परिवर्तन एक फ्लोरोसेंट रंजक है, जो iontophoretically प्रीसानेप्टिक न्यूरॉन में शुरू की है के साथ imaged. पूर्व और postsynaptic न्यूरॉन्स तो तेज इलेक्ट्रोड के साथ impaled कर रहे हैं तो कि synaptic प्रसारण और प्रेरित किया जा सकता है पर नजर रखी.
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Discussion
हम तकनीक है कि करने के लिए एक साथ intracellular कैल्शियम एकाग्रता की निगरानी और synaptic प्रसारण की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है प्रदर्शित करता है. इन तकनीकों का निर्धारण कैसे अल्पकालिक plasticity के विभिन्न रूपों की मध्यस्थता कर रहे हैं के लिए उपयोगी होते हैं.
इमेजिंग एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी और सीसीडी कैमरा के साथ किया जाता है. इन उपकरणों की आवश्यकताओं अपेक्षाकृत मामूली जब सबसे कार्यात्मक इमेजिंग सेट अप करने के लिए तुलना कर रहे हैं. तकनीक सरल और सीखने के लिए आसान है. जबकि एक सीसीडी कैमरा के साथ इमेजिंग अच्छा अस्थायी समाधान के साथ एक बड़े क्षेत्र के दृश्य की अनुमति देता है, स्थानिक संकल्प सीमित है. इसलिए यह परीक्षण hypotheses के लिए एक उपयोगी तकनीक intracellular कैल्शियम में अपेक्षाकृत व्यापक या 'पृष्ठभूमि बढ़ जाती है की भूमिका के विषय में है. स्थानिक संकल्प और कांटा में अध्ययन कैल्शियम गतिशीलता में सुधार, एक लेजर स्कैनिंग confocal सूक्ष्मदर्शी, या एक दो photon माइक्रोस्कोप और कैल्शियम सूचक कैल्शियम के ग्रीन मैं कर सकता10 प्रोटोकॉल का केवल मामूली संशोधनों के साथ इस्तेमाल किया जा.
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Disclosures
हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
एक PHS अनुदान (MH51393) इस काम का समर्थन किया. कुछ का उपयोग हम Aplysia के अनुसंधान संसाधन, एनआईएच के लिए राष्ट्रीय केंद्र से अनुदान RR10294 तहत मियामी के विश्वविद्यालय के Aplysia के लिए राष्ट्रीय संसाधन द्वारा प्रदान की जाती हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Calcium Orange | Invitrogen | C-3013 | |
| EGTA | Sigma | E-4378 | |
| Calcium calibration buffer kit | Invitrogen | C-3008MP | Useful for testing the sensitivity and dynamic range of the signal |
Table 1. Reagents used. |
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| FN-1 upright fluorescence microscope | Nikon Instruments | with Narishige ITS-FN1 stage | |
| NMN-21 manipulators | Narishige | mounted on stage with magnets | |
| CoolSNAP HQ2 CCD camera | Photometrics | ||
| NIS elements AR | Nikon Instruments | we used version 3.22 | |
| 10X/0.3w Plan Fluor objective | Nikon Instruments | this water immersion lens has a very long working distance of 3.5 mm | |
| X-Cite 120 PC metal halide lamp | EXFO | used for fluorescence imaging | |
| LS-DWL halogen lamp | Sumica | ||
| ET-CY3 filter set | Chroma Technology | ||
| Power 1401 A/D converter | Cambridge Electronic Design | sampling was done at 3 kHz | |
| Spike II Software | Cambridge Electronic Design | we used version 7.07 | |
| SEC-10 LX amplifier | NPI electronics | used with a 10X headstage | |
| Model 410 amplifier | Brownlee precision | used to amplify and filter the signal | |
| WS-4 | minus k Technology | vibration isolation for imaging | |
| cooling platform | custom made | brass plate through which ice water is pumped at a variable rate | |
Table 2. Equipment used. |
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References
- Zucker, R. S., Regehr, W. G.
- Eberhard, M., Erne, P. Calcium binding to fluorescent calcium indicators: Calcium green, calcium orange and calcium crimson. Biochem. Biophysical Res. Comm. 180, 209-215 (1991).
- Escobar, A. L., Velez, P., Kim, A. M., Cifuentes, F., Fill, M., Vergata, J. L. Kinetic properties of DM-nitrophen and calcium indicators: rapid transient response to flash photolysis. Eur. J. Physiol. 434, 615-631 (1997).
- Ivanov, A. I., Calabrese, R. L. Modulation of spike-mediated synaptic transmission by presynaptic background Ca2+ in leech heart interneurons. J. Neurosci. 23, 1206-1218 (2003).
- Rosen, S. C., Miller, M. W., Evans, C. G., Cropper, E. C., Kupfermann, I. Diverse synaptic connections between peptidergic radula mechanoafferent neurons and neurons in the feeding system of Aplysia. J. Neurophysiol. 83, 1605-1620 (2000).
- Ludwar, B. C. h, Evans, C. G., Jing, J., Cropper, E. C. Two distinct mechanisms mediate potentiating effects of depolarization on synaptic transmission. J. Neurophysiol. 102, 1976-1983 (2009).
- Evans, C. G., Ludwar, B. C. h, Askansas, J., Cropper, E. C. Effect of holding potential on the dynamics of homosynaptic facilitation. J. Neurosci. 31, 11039-11043 (2011).
- Haugland, R. P. The Handbook. , 10th edition, Invitrogen. (2005).
- Borovikov, D., Evans, C. G., Jing, J., Rosen, S. C., Cropper, E. C. A proprioceptive role for an exteroceptive mechanoafferent neuron in Aplysia. J. Neurosci. 20, 1990-2002 (2000).
- Goldberg, J. H., Yuste, R. Chapter 38: A practical guide: Two-photon calcium imaging of spines and dendrites. Imaging in Neuroscience and Development. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (2005).
