L'analisi di morfologia dendritica delle cellule di Purkinje in Culture Slice organotipiche
Summary
Presentiamo un protocollo che permette di visualizzare e valutare quantitativamente la morfologia dell'albero dendritico delle cellule di Purkinje singole coltivate in culture fetta organotipiche cerebellari. Questo protocollo ha lo scopo di promuovere gli studi sui meccanismi di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje.
Abstract
Cellule di Purkinje sono un sistema modello attraente per studiare lo sviluppo dendritico, perché hanno un albero impressionante dendritica strettamente orientato nel piano sagittale e si sviluppa prevalentemente nel periodo postnatale nei piccoli roditori 3. Inoltre, gli anticorpi sono disponibili diverse etichette che le cellule di Purkinje selettivamente e intensamente tra cui tutti i processi, con anti-Calbindin D28K essere il più utilizzato. Per la visualizzazione dei dendriti nelle cellule viventi, topi che esprimono EGFP selettivamente nelle cellule di Purkinje 11 sono disponibili attraverso laboratori Jackson. Organotipiche cerebellari culture fetta cellule permettono con facilità di manipolazione sperimentale di sviluppo dendritiche delle cellule di Purkinje perché la maggior parte dell'espansione dendritica della struttura dendritica delle cellule di Purkinje è effettivamente in atto durante il periodo di coltura 4. Vi presentiamo qui una breve, protocollo affidabile e semplice per la visualizzazione e l'analisi della morfologia dendritica delle cellule del Purkinje coltivate in organotypic culture fetta cerebellari. Per molti scopi, una valutazione quantitativa dell'albero dendritico delle cellule di Purkinje è auspicabile. Ci concentriamo qui su due parametri, le dimensioni dell'albero dendritico e numeri in virgola filiali, che possono essere rapidamente e facilmente determinabili da colture tinte anti-calbindina fetta cerebellari. Questi due parametri danno una misura affidabile e sensibile dei cambiamenti della struttura di Purkinje cellule dendritiche. Utilizzando l'esempio di trattamenti con la proteina chinasi C (PKC) attivatore PMA e il recettore metabotropici del glutammato 1 (mGluR1) si dimostra come le differenze nello sviluppo dendritico sono visualizzati e valutati quantitativamente. La combinazione della presenza di un albero dendritico ampio, metodi immunostaining selettivi ed intenso, culture fetta organotipiche che coprono il periodo di crescita dendritica e un modello di topo con cellule EGFP Purkinje espressione specifica marca cellule di Purkinje un sistema modello potente per rivelare i meccanismi di dendritico sviluppo.
Protocol
Discussion
I metodi qui presentati permettono di studiare lo sviluppo delle cellule di Purkinje dendritiche in colture organotipiche cerebellari fetta e valutare quantitativamente espansione Purkinje cellule dendritiche misurando dimensioni dendritiche albero e il numero di punti di ramificazione dendritiche. Naturalmente, un'analisi più ampia e sofisticata quantitativa dei dendriti delle cellule di Purkinje è possibile, ad esempio determinando lunghezza totale dendritiche, l'esecuzione di un'analisi Sholl o determin…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dal l'Università di Basilea, Dipartimento di Biomedicina, e il Fondo nazionale svizzero (31003A-116624).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Tissue culture Inserts | Millipore | PICM 03050 PICM ORG50 | The PICMORG50 inserts have a low rim and allow viewing of live cultures at a microscope |
| MEM | Gibco, Invitrogen | 11012044 | |
| Glutamax 1 | Gibco, Invitrogen | 35050038 | |
| Basal Medum Eagle | Gibco, Invitrogen | 41010026 | |
| Horse serum | Gibco, Invitrogen | 26050070 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Tocris | 1201 | |
| (RS)-3,5-Dihydroxy-phenylglycine (DHPG) | Tocris | 0342 | |
| Rabbit anti-calbindin D-28K | Swant | CB38 | |
| Anti NeuN, clone A60 | Chemicon, Millipore | MAB377 | |
| Rabbit anti-GFP | Abcam | Ab290 |
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