神经元形态的研究方法：<em>体外</em> RNAi技术在胚胎小鼠大脑皮质的电穿孔
Summary
我们描述涉及的方法进行快速评估的功能基因在大脑皮层的发展，<em>体外</em>电质粒共表达抑制核糖核酸（RNA干扰）和绿色荧光蛋白在小鼠胚胎皮层。该协议是适合研究神经发育的各个方面，如神经，神经细胞迁移和神经元的形态，包括树突和轴突生长。
Abstract
大脑皮质的指示较高的认知功能。这6个层状结构会产生一个内部第一，外部最后的方式，其中第一个出生的神经元保持密切的心室，而去年出生的神经元迁移过去的第一个出生的神经细胞向大脑表面1。除了 神经细胞迁移2，皮质功能正常的一个关键过程是调节神经元的形态3。虽然神经元形态，可在原代培养体外研究，有多少要了解到，从这些过程是如何在组织环境监管。
我们描述的技术来分析神经细胞迁移和/或在大脑皮层的器官切片4,6形态。用于修改一个pSilencer载体，其中包含同时U6启动子驱动的双链发夹RNA和一个单独的编码绿色荧光蛋白表达盒驱动b雅CMV启动子7-9。我们的方法允许候选基因的具体击倒后突起生长的缺陷快速评估，并已成功用于在屏幕上一个突起生长8监管。因为只有一部分细胞会表达的RNAi构造，器官切片允许镶嵌一个潜在的表型分析。此外，因为这种分析是在附近近似体内环境，它提供了一个低成本为皮质功能未知的基因，并迅速替代代转基因或基因敲除动物。最后，在体内电穿孔技术相比， 体外电击实验的成功是不依赖于熟练的手术技巧的发展，可以用更短的训练时间和技能进行。
Protocol
Discussion
这些方法包括体外电击质粒编码双链RNA发夹和器官切片4提供了几个明显的优势文化。首先，这些方法可以快速评估为RNAi派生的表型的。 pSilencer载体包含U6启动子驱动的双链RNA发夹编码绿色荧光蛋白表达盒中列入允许细胞电穿孔与RNAi载体的快速识别和表征。除了时间效率，这些方法具有高度成本效益的几个淘汰赛行产生相比。第二，与生存电技术12，需要较长的培训和技能?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢提供的pSil-GFP的结构图1的插图，博士阿尔珀乌尊，共聚焦显微镜勒杜克生物成像设备，博士希林Bonni。电解金属锰支持从巴勒斯惠康基金，NARSAD奖的年轻研究者，美国国立卫生研究院NCRR COBRE P20的RR018728-01职业医学科学奖。借券支持由美国国立卫生研究院NCRR COBRE P20的RR018728-01，并已收到小灵通NRSA 5T32MH019118-20的支持。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
Referências
- Angevine, J. B., Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
