Методы изучения морфогенеза нейронов:<em> Ex естественных условиях</em> RNAi Электропорация в эмбриональной коры головного мозга мышей
Summary
Для проведения экспресс-оценки функции генов в развитии коры головного мозга, мы опишем методы, связанные с<em> Бывший естественных условиях</em> Электропорации плазмид совместно выразить тормозные РНК (РНК-интерференции) и GFP в мышиных эмбриональных мозга. Этот протокол поддается изучению различных аспектов развития нервной системы, таких как нейрогенез, миграцию нейронов и нейронных морфогенеза в том числе дендритов и аксонов результат.
Abstract
Кора головного мозга направляет высших когнитивных функций. Это шесть слоистая структура создается в в первой, за пределами последней манере, в которой родился первый нейроны остаются ближе к желудочка в то время как последний родился нейроны мигрировать прошлом первенца нейронов на поверхности мозга 1. В дополнение к миграции нейронов 2, ключевой процесс для нормальной корковой функции регуляции морфогенеза нейронов 3. В то время как нейронные морфогенеза могут быть изучены в пробирке в первичных культурах, есть много можно извлечь из того, как эти процессы регулируются в тканях среды.
Мы опишем методы для анализа миграции нейронов и / или морфогенеза в органотипической кусочки коры головного мозга 4,6. PSilencer изменение вектора используется в который входят и промоутер U6, которая управляет двухцепочечной РНК шпильку и отдельные кассеты выражение, которое кодирует белок GFP приводом бя CMV промотора 7-9. Наш подход позволяет оперативно оценить дефекты в аксонов от конкретных нокдауна генов-кандидатов и успешно используется в экран для регуляторов аксонов 8. Потому что только часть клеток будет выражать RNAi конструкции, органотипической ломтиками позволяет мозаика анализ потенциальных фенотипов. Кроме того, поскольку этот анализ делается в ближайшем приближении в окружающую среду естественных условиях, он обеспечивает низкую стоимость и быстрая альтернатива поколение трансгенных животных или нокаут генов неизвестных корковых функций. Наконец, в сравнении с технологией электропорации в естественных условиях, успех бывшего экспериментов электропорации естественных условиях не зависит от развития навыков опытными хирургии и может быть выполнена с более короткие сроки подготовки и повышения квалификации.
Protocol
Discussion
Эти методы, связанные с бывшим электропорации естественных плазмид кодирования двухцепочечной РНК шпильки 8 и культуры органотипической ломтиками 4 обеспечивают несколько явных преимуществ. Во-первых, эти методы позволяют быстро оценить RNAi производных фенотипо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Ширин Бонни для обеспечения pSil-GFP конструкции, доктор Альпер Узун для иллюстрации на рисунке 1, а Ледюк объекта Bioimaging для конфокальной микроскопии. EMM поддерживает Карьера премии за медицинской науки от Burroughs Wellcome Фонд NARSAD премия для молодых исследователей и NIH NCRR Кобре P20 RR018728-01. SBL поддерживается NIH NCRR Кобре P20 RR018728-01, и получил поддержку со стороны PHS НРСА 5T32MH019118-20.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Hamilton syringe | HAMILTON | 80008 | 31 gauge, 0.5 inches long,PT-4 (level of point beveling), 10μl volume |
| Platinum tweezertrodes | BTX | 45-0489 | 5mm size |
| ECM830 electroporator | BTX | 45-0002 | |
| BTX Footswitch | BTX | 45-0208 | For use with ECM830 electroporator |
| Vibrating blade microtome | LEICA | VT1000 S | |
| 6- well dish to use with inserts | FALCON | 353502 | Contains notches to fit inserts |
| Tissue culture inserts | FALCON | 353090 | 0.4 micrometer |
| Fast Green | SIGMA | F7252 | |
| Low Melting Agarose | FISHER | BP165-25 | DNA grade |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P5899 | |
| Basal Medium Eagle | Sigma Aldrich | B-1522 | |
| HBSS 10x without Ca and Mg | GIBCO | 14180-046 | |
| HEPES-free acid | Sigma- Aldrich | H4034 |
Referências
- Angevine, J. B., Sidman, R. L. Autoradiographic study of cell migration during histogenesis of cerebral cortex in the mouse. Nature. 192, 766-766 (1961).
- Kriegstein, A. R., Noctor, S. C. Patterns of neuronal migration in the embryonic cortex. Trends Neurosci. 27, 392-392 (2004).
- Barnes, A. P., Polleux, F. Establishment of axon-dendrite polarity in developing neurons. Annu. Rev. Neurosci. 32, 347-347 (2009).
- Haydar, T. F., Bambrick, L. L., Krueger, B. K., Rakic, P. Organotypic slice cultures for analysis of proliferation, cell death, and migration in the embryonic neocortex. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4, 425-425 (1999).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal. Sci. STKE. 2002, pl9-pl9 (2002).
- Guerrier, S. The F-BAR domain of srGAP2 induces membrane protrusions required for neuronal migration and morphogenesis. Cell. 138, 990-990 (2009).
- Stegmuller, J. Cell-intrinsic regulation of axonal morphogenesis by the Cdh1-APC target SnoN. Neuron. 50, 389-389 (2006).
- Sepp, K. J. Identification of neural outgrowth genes using genome-wide RNAi. PLoS Genet. 4, e1000111-e1000111 (2008).
- Konishi, Y. Cdh1-APC controls axonal growth and patterning in the mammalian brain. Science. 303, 1026-1026 (2004).
- Vankelecom, H. Fixation and paraffin-embedding of mouse tissues for GFP visualization. Cold Spring Harb Protoc. 2009, 5298-5298 (2009).
- Hand, R. Phosphorylation of Neurogenin2 specifies the migration properties and the dendritic morphology of pyramidal neurons in the neocortex. Neuron. 48, 45-45 (2005).
- Taniguchi, Y., Young-Pearse, T., Sawa, A., Kamiya, A. In Utero Electroporation as a Tool for Genetic Manipulation in Vivo to Study Psychiatric Disorders: From Genes to Circuits and Behaviors. Neuroscientist. 18, 169-179 (2012).
