מהיר<em> In vivo</em> Assay לבדיקת תרכובות neuromodulatory באמצעות מערכת סיבים הענק (GFS) של<em> תסיסנית melanogaster</em> מתוארת. Nanoinjections בראש של חיה יחד עם הקלטות של אלקטרו GFS יכול לחשוף bioactivity של תרכובות על עצב או שריר.
תרכובות סינון עבור בפעילות vivo יכול לשמש כצעד ראשון כדי לזהות מועמדים שניתן התפתח 1,2 סוכני תרופתי. פיתחנו nanoinjection / electrophysiology הרומן assay המאפשר זיהוי של תופעות modulatory ביו של תרכובות על הפונקציה של מעגל עצבי מתווכת תגובה מפלט תסיסנית melanogaster 3,4. שלנו assay vivo, אשר עושה שימוש במערכת הענק תסיסנית סיבים (GFS, איור 1) מאפשר הקרנה של סוגים שונים של תרכובות, כגון מולקולות או פפטידים קטנים, ודורשת רק כמויות מינימליות כדי לעורר אפקט. בנוסף, GFS תסיסנית מציעה מגוון רחב של מטרות מולקולריות אפשריות על עצב או שריר. סיבי ענק (GFS) סינפסה חשמלית (GAP כלאיים), וכן כימי (כולינרגית) על Synapsing Interneuron היקפיים (PSI) ו Trochanteral Tergo שריר תא עצב (TTMn) 5 </sup>. PSI חיבור (שריר הגבי נוירון אורך) DLMn תלויה Dα7 קולטני אצטילכולין ניאציניות (nAChRs) 6. לבסוף, צמתים neuromuscular (NMJ) של TTMn ו DLMn עם קפיצה (TTM) ואת שרירי התעופה (DLM) הם glutamatergic 7-12. כאן, אנו מדגימים כיצד להזריק כמויות nanoliter של המתחם, תוך קבלת הקלטות תאיים אלקטרו ממערכת סיבים Giant 13 ואיך לפקח על השפעותיה של התרכובת על הפונקציה של מעגל זה. אנחנו מראים הספציפיות של assay עם ציטראט methyllycaconitine (MLA), אנטגוניסט nAChR, אשר משבש את PSI כדי DLMn חיבור אבל לא GF כדי TTMn חיבור או פונקציה של NMJ על קפיצה או שרירי התעופה.
לפני תחילת הווידאו הזאת זה קריטי, כי אתה בזהירות לראות ולהכיר את הסרטון שכותרתו "יופיטר הקלטות אלקטרו מן השביל סיב הענק של ד melanogaster "מ אוגוסטין ואח' 7, כמו וידיאו המוצג כאן נועד כהרחבה לטכניקה זו הקיימת. כאן אנו משתמשים בשיטה הקלטות אלקטרו ולהתמקד בפרטים רק על תוספת של nanoinjections לזווג וטכניקה ניטור.
המבדק nanoinjection / electrophysiology המוצג כאן מאפשר סינון מהיר של תרכובות במערכת העצבים של זבוב הפירות. זהו רומן בטכניקה vivo הדורש כמויות קטנות של חומר כדי לעורר השפעה על מגוון רחב של מטרות מולקולריות במעגל עצבי היטב מאופיין. בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לבדוק את bioactivity של תרכוב?…
The authors have nothing to disclose.
היינו רוצים להכיר את חברי המעבדה מארי ואת המעבדה Godenschwege, במיוחד אלין Yonezawa, להערות ועזרה פרוטוקול זה. עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי להפרעות נוירולוגיות ושבץ מענק R21NS06637 כדי FM, TAG, א.ב. מומן על ידי מספר קרן המדע הלאומית פרס 082925, URM: לביולוגיה אינטגרטיבית עבור חוקרים עתידיים.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Recording glass electrodes: borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | 1.0mm OD, 0.58mm ID |
Stimulator | Grass Instruments | Model S48 | |
Amplifier | Getting Instruments Inc. | Model 5A | |
Data acquisition Software: Digidata | Molecular Devices | Model 1440A | |
Data collection software: pCLAMP | Molecular Devices | Version 10 | |
Stereomicroscope with fiber optic microscope ring illuminator | AmScope | SM-4T Model HL250-AR |
|
Dissecting scope for mounting | AmScope | SM-2TZ | |
Kite Manual Micromanipulator & Tilting Base | World Precision Instruments | Model # M3301 Kite: Model # KITE-M3-L |
|
Drosophila melanogaster Wild 10E genotype (wild type strain) | Bloomington Stock center | Stock # 3892 | |
Vertical pipette puller | David Kopf Instruments | Model 700c | |
Injection glass micropipettes: Borosilicate glass capillaries | World Precision Instruments | Catalogue # 4878 | 1.14mm OD, 0.5mm ID |
Silicon oil | Fisher | Catalogue # S159-500 | |
Beveler | Sutter Instrument Co. | K.T. Brown Type Model # BV-10 |
|
Nanoliter2000 | World Precision Instruments | Catalogue # B203XVY | |
Blue food coloring | McCormick | N/A | Ingredients: Water, Propylene Glycol, FD&C Blue 1, and 0.1% Propylparaben (preservative). |
Methyllycaconitine citrate (MLA) | Tocris Bioscience | Catalogue # 1029 | |
Plastic wax sticks | Hygenic Corporation (Akron Ohio USA) |