Summary

Une méthode pour l'étiquetage dans les vaisseaux sanguins souris embryonnaires

Published: October 07, 2011
doi:

Summary

Cet article décrit une méthode pour l'étiquetage de peau embryonnaire et les vaisseaux sanguins du thymus.

Abstract

La mise en place d'un réseau de vaisseaux sanguins fonctionnelle est une partie essentielle de l'organogenèse, et est requis pour la fonction des organes optimale. Par exemple, dans la formation adéquate vascularisation du thymus et de structuration est indispensable pour l'entrée dans l'organe thymocytes matures et les cellules T de sortie vers la périphérie. La disposition spatiale des vaisseaux sanguins dans le thymus est dépendante des signaux du micro-environnement local, à savoir les cellules épithéliales thymiques (TEC). Plusieurs rapports récents suggèrent que la perturbation de ces résultats signaux dans la cuve 1,2 thymus défauts sang. Des études précédentes ont décrit les techniques utilisées pour étiqueter les 1,2 vascularisation néonatale et adulte du thymus. Nous démontrons ici une technique de marquage des vaisseaux sanguins dans le thymus embryonnaire. Cette méthode combine l'utilisation de FITC-dextran ou Griffonia (Bandeiraea) lectine Simplicifolia I (GSL 1 – isolectine B 4) injections veine faciale et CD31 coloration des anticorps pour identifier les structures vasculaires du thymus et PDGFR-β à l'étiquette du thymus périvasculaire mésenchyme 3-5. L'option d'utiliser cryocoupes ou sections vibratome est également fourni. Ce protocole peut être utilisé pour identifier les défauts du thymus vasculaire, ce qui est essentiel pour définir les rôles des molécules dérivées de TCE dans la formation des vaisseaux sanguins du thymus. Comme la méthode des étiquettes de la vascularisation entier, il peut aussi être utilisée pour analyser les réseaux vasculaires dans de multiples organes et de tissus dans l'embryon, y compris la peau et le cœur 6-10.

Protocol

1. Marqué à la fluorescéine dextrane et GSL I-isolectine B 4 injections veine faciale à l'étiquette vascularisation embryonnaire Préparer FITC-dextran (50ug/mL) en tampon phosphate salin (PBS) ou GSL 1 – isolectine B 4 (20ug/200uL) dans du PBS dans un tube Eppendorf de 1,5 ml et chaud à 37 ° C. Ajouter 100 ul de stock 1,25 vert rapide / PBS à la solution de FITC-dextran (volume total 1 ml) et 180uL de stock 1,25 Fast Green / PBS à l'une GSL – isolectine B 4 (…

Discussion

Whole-monter et PECAM-1 (CD31) sur la coloration des sections sont les méthodes classiques pour l'étiquetage de la vascularisation de souris embryonnaires. Ces méthodes nécessitent l'utilisation d'immunofluorescence directe et / ou indirects, et des détergents pour perméabiliser les tissus de la souris. Cela s'avère un processus plutôt rapide. Ici, nous avons employé FITC-dextran ou isolectine B 4 injections veine faciale pour marquer directement la vascularisation embryonnaire, élim…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été soutenu par numéros de subvention et de R01AI055001 R01AI082127 du NIAID à la GRN et le Prix SREB bourse de thèse à JLB.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number
FITC-dextran Sigma FD150S-1G
Fluorescein labeled GSL 1 – isolectin B4 Vector Laboratories FL-1201
Fast Green MP Biomedicals 195178
PFA Fluka 76240
Fetal Bovine Serum Atlanta Biologicals S11550
Optimal Cutting Temperature Compound (O.C.T. VWR 25608-930
Acetone JT Baker 9006-33
Donkey Serum Jackson 017-000-121
rat anti-mouse CD31, BD Pharmingen 558736
goat anti-mouse PDGFR-β R&D Systems AF1042
donkey anti-rat CD31 Alexa 647 (Invitrogen) Biolegend 102516
donkey anti-goat Alexa 594 (Invitrogen) Invitrogen A11058
Triton X -100 Sigma-Aldrich X-100
Low melt agarose/PBS Sigma-Aldrich A9414-25G
Methanol Fisher Scientific A413-4
Benzyl Alcohol Acros Scientific 148390010
Benzyl Benzoate Acros Scientific 105860010
Depression slides Fisher Scientific S175201
Fluorogel Electron Microscopy Sciences 17985-10
Cover Glass (22X22)-1.5 Thermo Scientific 152222
Zeiss LSM 510 Meta Confocal Microscope Zeiss  
Micro dissecting forceps Roboz RS-5135
Parafilm No. OM992 Fisher Scientific 13-374-16
12 and 24 well microplates Evergreen Scientific 222-8044-01F
Superfrost/Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15
4mL clear vials National Scientific B7800-2

Referências

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Citar este artigo
Bryson, J. L., Coles, M. C., Manley, N. R. A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice. J. Vis. Exp. (56), e3267, doi:10.3791/3267 (2011).

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