Summary

Zoledronate İnsan Periferik Kan Genişleme γδ T Hücreler

Published: September 09, 2011
doi:

Summary

Γδ T hücreleri periferik kan mononükleer hücreleri (hücre) genişletmek için bir yöntem açıklanmıştır. Hücre-kökenli γδ T hücreleri uyarılır ve zoledronate ve interlökin-2 (IL-2) ile genişletilir. Γδ T hücrelerinin büyük ölçekli genişlemesi kanser otolog hücresel immünoterapi uygulanabilir.

Abstract

İnsan γδ T hücreleri tanımak ve stres kaynaklı antijenleri geniş bir yelpazede cevap, böylece doğuştan gelen geniş bir anti-tümör ve anti-enfektif aktivite gelişmekte olan 1, periferik kan γδ T hücrelerinin çoğunluğu Vγ9Vδ2 T hücre reseptör var . Bu hücreler, büyük doku uygunluk kompleksi-bağımsız bir şekilde antijeni tanıması ve güçlü sitolitik ve Th1 gibi efektör fonksiyonları gelişir. 1 Bu nedenle, γδ T hücrelerinin, kanser immünoterapi için cazip aday efektör hücreleri vardır. Vγ9Vδ2 T hücreleri gibi phosphoantigens cevap (E)-4-hidroksi-3-metil-ama-2-enyl pirofosfat (HMBPP), izoprenoid biyosentezi ile bakteriler sentezlenir; üretilen 2 ve izopentenil pirofosfat (IPP), mevalonata yolu 3 fizyolojik durumu ile ökaryot hücreler, IPP nontransformed hücre üretimi γδ T hücrelerinin aktivasyonu için yeterli değildir. Düzensizliği, tümör hücrelerinde mevalonata yolun IPP birikimi ve γδ T hücrelerinin aktivasyonu yol açar. 3 aminobisphosphonates (örneğin, pamidronat veya zoledronate) farnesil pirofosfat sentaz (SOP), mevalonata yolu IPP mansabında hareket eden enzim, hücre içi düzeylerini inhibe Çünkü γδ T hücreleri tanıma IPP ve sensitibity terapötik aminobisphosphonates artabilir. IPP birikimi nontransfomred hücreleri aminobisphosphonates ile γδ T hücreleri aktive ederek kanser için bize izin immünoterapi aminobisphosphonates farmakolojik ilgili bir konsantrasyon ile tümör hücrelerinin daha az verimlidir. PBMC aminobisphosphonates ile tedavi edildiklerinde 4 İlginçtir, IPP çünkü verimli, monositler birikir bu hücreler tarafından ilaç alımı. IPP antijen-sunan hücreler haline ve periferik kan Vγ9Vδ2 T hücreleri uyarmak birikir 5 Monositler 6 bu mekanizmalar dayanarak, biz γδ T hücre kültürleri zoledronate ve interlökin kullanarak büyük ölçekli genişlemesi için bir teknik geliştirdi -2 (IL-2). sentetik phosphoantigens bromohydrin pirofosfat (BrHPP) 8 ya da 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfat (2M3B1PP) 7 γδ T hücrelerinin genişlemesi için diğer yöntemler kullanmaktadır. 9 Tüm bu yöntemlerin eski izin evlatlık immünoterapi kullanmak için γδ T hücrelerinin çok sayıda in vivo genişlemesi. Ancak, zoledronate sadece bir FDA onaylı piyasada bulunan reaktif. CD45RA – – Zoledronate-genişletilmiş γδ T hücreleri CD27 ekran efektör bellek fenotipi ve fonksiyonu IFN-γ üretimi tahlil 7 değerlendirilebilir.

Protocol

1. PBMC, izolasyon BD Vacutainer CPT Hücre Hazırlık Tüp Sodyum Heparin ile kan (7,5-8,0 ml) çizin. Tüp sodyum heparin, antikoagülan ve Ficoll Hypaque yoğunluğu sıvı, artı, iki sıvı ayıran bir polyester jel bariyer, içerir. 1800 x g'de 20 dakika boyunca yatay bir rotor (dışarıya başını) oda sıcaklığında (18 ° C – 25 ° C) tüp / kan örneği santrifüjleyin . Frenler santrifüj geçin. Santrifüj sonra, katmanlar dizisi (yukarıdan aşağıya doğru görülen) …

Discussion

Burada sunulan yöntem PBMC γδ T hücrelerinin verimli genişleme sağlar. γδ T hücrelerinin etkinleştirilmesi ve geliştirilmesi zoledronate ve IL-2 sitokin üretim ve sitotoksisiteye yansıyan tam efektör fonksiyonları, geliştirmek. Bildirilmiştir sentetik phosphoantigens bromohydrin pirofosfat (BrHPP) ve 2-metil-3-butenyl-1-pirofosfat (2M3B1PP) γδ T hücreleri genişletmek, ancak ticari olarak mevcut değildir. Buna karşılık, zoledronate zaten Zometa gibi klinik uygulamalar için lisanslıdır. Bu nede…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Materials

Reagent name Company Catalogue number Comments (optional)
ZOMETA Novartis Pharma K. K   zoledronate
PROLEUKIN Novartis Pharmaceuticals   human recombinant IL-2
BD Vacutainer CPT Cell Preparation Tube with Sodium Heparin BD 362753  
RPMI1640 Invitrogen 21870-076  
ALyS203- medium Cell Science & Technology Institute 0301-7  
OpTmizer Invitrogen 0080022SA  
brefeldin A Sigma B5936-200UL  
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma P1585-1MG  
ionomycin Sigma 13909-1ML  
IntraPrep BECKMAN COULTER A07803  
anti-human CD3-FITC or PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07746 FITC
A07749 PE/Cy5
 
anti-human CD4-ECD BECKMAN COULTER 6604727  
anti-human CD8-PE/Cy5 BECKMAN COULTER 6607011  
anti-human CD14-PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07765  
anti-human CD19-PE BECKMAN COULTER A07769  
anti-human CD45-ECD BECKMAN COULTER A07784  
anti-human CD56-PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07789  
anti-human TCRαβ-PE BECKMAN COULTER A39499  
anti-human TCR Vγ9-FITC BECKMAN COULTER IM1463  
anti-human CD27-PE/Cy5 BECKMAN COULTER 6607107  
anti-human CD45RA-ECD BECKMAN COULTER IM2711  
anti-human CD69-PE BD 555531  
anti-human NKG2D-PE BECKMAN COULTER A08934  
Anti-humal IFNγ-PE BECKMAN COULTER IM2717U  
Mouse IgG1 isotype control-PE BECKMAN COULTER A07796  
Mouse IgG1 isotype control-ECD or PE/Cy5 BECKMAN COULTER A07797 A07798  

Referências

  1. Bonneville, M., O’Brien, R. L., Born, W. K. γ T cell effector functions: a blend of innate programming and acquired plasticity. Nat Rev Immunol. 10, 467-478 (2010).
  2. Hintz, M. Identification of (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate as a major activator for human γδ T cells in Escherichia coli. FEBS Lett. 509, 317-322 (2001).
  3. Gober, H. J. Human T cell receptor γδ cells recognize endogenous mevalonate metabolites in tumor cells. J Exp Med. 197, 163-168 (2003).
  4. Kabelitz, D., Wesch, D., He, W. Perspectives of gammadelta T cells in tumor immunology. Cancer Res. 67, 5-8 (2007).
  5. Roelofs, A. J. Peripheral blood monocytes are responsible for gammadelta T cell activation induced by zoledronic acid through accumulation of IPP/DMAPP. Br J Haematol. 144, 245-250 (2009).
  6. Dieli, F. Induction of γδ T-lymphocyte effector functions by bisphosphonate zoledronic acid in cancer patients in vivo. Blood. 102, 2310-2311 (2003).
  7. Kondo, M. Zoledronate facilitates large-scale ex vivo expansion of functional γδ T cells from cancer patients for use in adoptive immunotherapy. Cytotherapy. 10, 842-856 (2008).
  8. Espinosa, E. Chemical synthesis and biological activity of bromohydrin pyrophosphate, a potent stimulator of human γδ T cells. J Biol Chem. 276, 18337-18344 (2001).
  9. Kobayashi, H. Safety profile and anti-tumor effects of adoptive immunotherapy using γδ T cells against advanced renal cell carcinoma: a pilot study. Cancer Immunol Immunother. 56, 469-476 (2007).
  10. Murali-Krishna, K. Counting antigen-specific CD8 T cells: a reevaluation of bystander activation during viral infection. Immunity. 8, 177-187 (1998).
  11. Sato, K. Impact of culture medium on the expansion of T cells for immunotherapy. Cytotherapy. 11, 936-946 (2009).
  12. Abe, Y. Clinical and immunological evaluation of zoledronate-activated Vγ9 γδT-cell-based immunotherapy for patients with multiple myeloma. Exp Hematol. 37, 956-968 (2009).
  13. Nakajima, J. A phase I study of adoptive immunotherapy for recurrent non-small-cell lung cancer patients with autologous γδ T cells. Eur J Cardiothorac Surg. 37, 1191-1197 (2010).

Play Video

Citar este artigo
Kondo, M., Izumi, T., Fujieda, N., Kondo, A., Morishita, T., Matsushita, H., Kakimi, K. Expansion of Human Peripheral Blood γδ T Cells using Zoledronate. J. Vis. Exp. (55), e3182, doi:10.3791/3182 (2011).

View Video