描述一个简单方便的方法,以确定视网膜神经细胞之间的缝隙连接示踪剂耦合程度。这种技术,使一个完整的视网膜中的神经元之间的电突触的功能,不同的光照条件下,在白天和晚上不同时间的调查。
除了化学突触传递,神经元缝隙连接连接也可以通过电突触传递迅速沟通。越来越多的证据表明,间隙连接不仅允许电流流动和细胞之间的相互关联或耦合的同步活动,但细胞之间的耦合强度或电气通信的有效性,可调制, 在很大程度上1,2。此外,内径大,许多缝隙连接通道(〜1.2 nm的)不仅允许电流流动,而且细胞内信号分子和细胞之间的相互关联的小代谢产物的扩散,使缝隙连接,也可调解代谢及化学通讯。同时电气耦合细胞记录和决定吨的神经元之间的差距及其神经递质及其他因素的调制交界通信的实力,可以研究他示踪分子的扩散,这是缝隙连接透水程度,但没有膜透水后,成单个细胞iontophoretic注射。然而,这些程序可以是非常困难的小somata完好的神经组织的神经元执行的。
在脊椎动物视网膜电突触和电气通信调制大量的研究已经进行,因为每五个视网膜神经类型是电连接缝隙连接3,4。越来越多的证据表明,昼夜(24小时)在光刺激视网膜和变化的时钟调节间隙连接耦合 3-8 。例如,最近的工作表明视网膜生物钟,减少白天的交界处耦合杆和锥感光细胞之间的差距,通过增加多巴胺D2受体激活,并通过降低D2受体的激活显着增加夜间杆锥耦合<suP> 7,8。然而,不仅是这些研究非常困难的小somata完整的神经视网膜组织中神经元执行,但它可能很难充分控制在单一的视网膜神经细胞的电生理研究的光照条件,以避免在缝隙连接的光致变化电导。
在这里,我们提出了一个简单的方法确定不同的光照条件下,在白天和黑夜的不同时期的视网膜神经细胞之间的缝隙连接示踪剂耦合程度。这种切割加载技术是9-12的修改刮加载,这是基于对染料的装载和扩散通过开放的间隙连接通道。刮装载工程以及在培养的细胞,但不厚片,如完整的视网膜。削减加载技术已用于研究在完整的鱼和哺乳动物视网膜7,8,13的感光耦合,可以用来研究之间的耦合其他视网膜神经细胞,这里描述。
这里描述的剪切加载方法是有用的和简单的技术来确定不同的光照条件下,在白天和黑夜的不同时期的视网膜神经细胞之间的缝隙连接示踪剂耦合的程度。这种技术的优点包括能够完整的视网膜组织中的神经元之间的缝隙连接示踪剂耦合程度量化各种光照条件下,白天和晚上的耦合神经元的小直径somata。在完整的组织分为两大类下降缝隙连接的研究技术的限制。首先,通过开放的缝隙连接示踪剂的扩散可能会比较难以观察到,由于A)小直径或与开放渠道和B),加上蜂窝车厢的相对体积1,14,15相关的费用。也就是说,从一个小细胞示踪扩散到一个较大的细胞或组耦合细胞,比赛ared从一个较大的细胞,以较小的细胞示踪扩散,可能会更加难以发现由于示踪稀释。第二,某些生理条件下,通过缝隙连接在完整组织的示踪扩散的程度可能无法准确反映的缝隙连接电导的实力相比,比较大的示踪通透性由于在小电流携带离子电导的差异,分子1,14,15。在一般情况下,示踪耦合的证据有力地表明运作,开放的间隙连接通道的存在,但某些生理条件下,示踪扩散可能不会发生或观察到,尽管电生理记录表明存在的运作,打开缺口路口。
这很可能削减加载技术还可以用于研究完整的组织从其他地区的中枢神经系统的神经元之间的缝隙连接示踪剂耦合程度TEM。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由国立卫生研究院授予EY005102 SCM和EY018640中华人民共和国
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Tricaine methane sulfonate (MS222) | Sigma-Aldrich | A5040 | 150 mg/L of buffered fish tank water |
Urethane | Sigma-Aldrich | U2500 | 2 g/kgloading dose |
Dual Tube Night Vision Goggle | Night Optics USA | D-221 | |
Filter Paper, Grade No. 4 | Whatman | 1004-090 | |
Fine Forceps, Dumont No. 5, Biologie, 11 cm long | Fine Science Tools | 11295-10 | |
Fine Scissors, spring-loaded, 8 mm blade, straight | Fine Science Tools | 15025-10 | |
Neurobiotin | Vector | SP-1120 | 0.5% |
Streptavidin-conjugated Alexa 488 | Invitrogen | S11223 | 2% |
Dextran rhodamine(high (> 10,000) MW) | Invitrogen | D1817 | 0.5% |
Vectashield mounting medium | Vector | H-1000 | |
Zeiss 510 META Laser Scanning Confocal Microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
LSM-5 Image Browser 3,2,0,115 | Carl Zeiss, Inc. | ||
ImageJ Software | NIH | ||
OriginPro 8.0 | OriginLab Corp. |