Yetişkin Tüm Dağı Hazırlık Drosophila Dev Fiber Boya Enjeksiyon Ventral Sinir Kablosu
Summary
Bir<em> In vivo</em> Yetişkin diseksiyonu<em> Drosophila</em> Ventral sinir kablosu (VNC) gösterilmiştir. Bu özel diseksiyon yöntemi, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için floresan boya ile dev bir fiber nöronların sonraki etiketleme sağlayan VNC az zarar neden olur.
Abstract
Nöronların aksonal ve dendritik morfoloji analiz etmek, doğru etiketleme nöronal yapıları elde etmek için esastır. Az doku hasarı iyi etiketli numunelerin hazırlanması dolayısıyla mutant anomalilerin kimlik sağlayan, bize hücre morfolojisi analiz etmek ve bireysel örnekleri birbirleriyle karşılaştırmak için sağlar.
Sinir sistemi göstermiştir diseksiyon yöntemi daha çok erişkin sinek içinde kalır. Dorsal bir kesiden karın ve göğüs açılır ve iç organların çoğu kaldırılır. GF hücre gövdesi ve dendritler içeren beyin sağlam bir kafa 2 kalırken ventral sinir kablosu (VNC) ve dev lifleri (GDS) 1 büyük aksonları içeren servikal bağ (CVC) sadece sırt tarafında açıkta . Bu hazırlanmasında VNC en sinirlerin kaslara bağlı kalmalıdır.
Diseksiyonu takiben, floresan boya ile dev bir lif (GF) hücre içi dolum gösterilmiştir. CVC GF aksonlar dorsal yüzeyinde bulunan ve bu nedenle diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik bir mikroskop altında kolayca görüntülenebilmekte. Bu VNC akson ve kendi terminalleri dahil olmak üzere tüm GF GF akson boya ile bu sitede enjeksiyon etiket sağlar. Bu yöntem, nöronların bir epifluorescent mikroskop ile doldurduktan sonra hemen yansıması izin GF'lerin güvenilir ve güçlü boyama ile sonuçlanır. Alternatif olarak, floresan sinyali, yüksek çözünürlüklü konfokal mikroskopi için uygun standart immünohistokimya prosedürleri 3 kullanarak gelişmiş olabilir .
Protocol
Discussion
Sinir sistemi, anında vücuttan ayıklanan olmadan disseke edilebilir. Bu, iki avantajı vardır, ilk diseksiyon sinir sistemi için çok az hasara neden olur, ve ikincisi, sinirler, kaslar ve duyu organları bağlı kalmak. Olarak tanımlanan diseksiyonu, Sahne GF'lerin yalındır boya-etiketleme için örnek hazırlar. Elverişli, GF'lerin postsinaptik motor nöronlar kaslara bağlı kalmak. Aksonlar, bu nedenle, nöronlar daha uzun süre canlı tutmak, hasarsız. Buna ek olarak, sinir sistemine zarar gap jun…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Açıklanan projenin içeriği sadece yazarların sorumluluğundadır ve mutlaka, Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi veya Enstitüsü resmi görüşlerini temsil etmemektedir TAG Hibe Numarası R01HD050725 Ulusal Çocuk Sağlığı ve İnsan Gelişimi Enstitüsü tarafından desteklenen Ulusal Sağlık Enstitüleri. Biz, el yazması ve video girişi için Godenschwege laboratuvar yanı sıra Barbara Schreader üyelerine teşekkür ediyorum.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Referências
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Boerner, J., Duch, C. Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord. J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity. J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology. J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).
- Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation. Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).
- Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation. J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).
- Storkebaum, E. Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS). Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. , (2011).
