Summary

Hela berget Beredning av vuxna Drosophila På magen Nerve Snodd till Giant Fiber Dye Injection

Published: June 04, 2011
doi:

Summary

En<em> In vivo</em> Dissekering av den vuxna<em> Drosophila</em> Ventrala nerv sladd (VNC) är påvisas. Denna speciella dissekeringsmetod orsakar små skador på VNC låta den efterföljande märkning av jätten fiber nervceller med fluorescerande färg för hög upplösning.

Abstract

Att analysera axonal och dendritiska morfologi av nervceller, är det viktigt att få en korrekt märkning av neuronala strukturer. Förbereda väl märkta prover med liten eller ingen vävnadsskada ger oss möjlighet att analysera cellmorfologin och jämföra enskilda prover med varandra, därav det möjligt att identifiera mutant anomalier.

I den visade dissekeringsmetoden nervsystemet är mest inne i vuxen flyga. Genom en dorsal snitt, är buken och bröstkorgen öppnas och de flesta av de inre organen tas bort. Endast ryggsidan av den ventrala nerv sladd (VNC) och livmoderhalscancer bindväv (CVC) som innehåller den stora axoner i den gigantiska fibrer (GF) 1 är utsatta, medan hjärnan som innehåller GF cellkroppen och dendriter återstår 2 i den intakta huvudet . I denna beredning flesta nerver av VNC bör sitta kvar sina muskler.

Efter dissektion, är den intracellulära fyllning av jätten fiber (GF) med en fluorescerande färg påvisas. I CVC GF axoner finns vid rygg-ytan och därmed lätt kan visualiseras i mikroskop med differential interferens kontrast (DIC) optik. Detta gör att injektionen av GF axoner med färg på denna webbplats för att märka hela GF inklusive axoner och deras terminaler i VNC. Metoden ger pålitlig och stark färgning av GF låta nervceller som ska avbildas direkt efter påfyllning av en epifluorescent mikroskop. Alternativt kan fluorescerande signalen förstärkas med hjälp av vanliga immunhistokemi procedurer 3 lämpar sig för hög upplösning konfokalmikroskopi.

Protocol

1. Dissekering av den ventrala nerv sladden Dissektion och färg fyllning av GF kan utföras vid rumstemperatur. För alla dissektion steg kyla (4 ° C) koksaltlösning bör användas för att bromsa cellernas ämnesomsättning och hålla nervceller vid liv längre. Bedöva vuxna flugor (4 dagar eller äldre) med CO 2 eller kyla dem på is tills de är orörlig. Anesthetizing med is kommer att kräva mer tid (upp till 30 min) men kommer att hålla flugorna orörlig unde…

Discussion

Nervsystemet kan dissekeras utan att ta bort det från flugan kroppen. Detta har två fördelar, först orsakar dissektion små skador på nervsystemet, och för det andra, de flesta nerverna vara kopplad till muskler och sinnesorgan. Utföra dissekering, enligt beskrivningen, förbereder provet för rakt fram dye-märkning av GF. Bekvämt, de motoneurons postsynaptiska till GF förbli anslutna till musklerna. Axoner, därför är oskadade, hålla nervceller vid liv längre. Dessutom är skador på nervsystemet kommer a…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Projektet beskrivs stöddes av licensnummer R01HD050725 från National Institute of Child Health and Human Development för att märka innehållet är uteslutande ansvarig för författare och inte nödvändigtvis representerar officiella ståndpunkter National Institute of Child Health och Human Development eller National Institutes of Health. Vi tackar medlemmar Godenschwege labbet samt Barbara Schreader för deras bidrag till manuskriptet och video.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning    
Dissection Microscope AmScope SM-2TZ  
Vannas Scissors Superfine Academic Instruments VS1023  
Dumont Forceps Dumontstar 55 Fine Science Tools 11295-51  
Austerlitz Insect pins Fine Science Tools 26002-10 Ø 0.1mm
Borosilicate Glass Electrodes World Precision Instruments 1B100F-4  
Vertical Pipette Puller 700c David Kopf Instruments Model 700C  
Lucifer Yellow CH dilithium salt Sigma L0259 1% in H2O
Fixed Stage Upright Microscope & Camera Nikon FN-1 & DS-U2 Camera  
Plan Fluor 10X Air Objective Nikon CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm  
Fluor 40X water dipping Objective Nikon CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm  
3D hydraulic Micromanipulator Narishige International Model MW0-3  
Amplifier Getting Instruments, Inc. Model 5A  

Referências

  1. Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
  2. Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
  3. Boerner, J., Duch, C. Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord. J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).
  4. Gu, H., O’Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity. J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).
  5. Boerner, J., Godenschwege, T. A. Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology. J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).
  6. Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation. Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).
  7. Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation. J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).
  8. Storkebaum, E. Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).
  9. Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS). Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).
  10. Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. , (2011).
check_url/pt/3080?article_type=t

Play Video

Citar este artigo
Boerner, J., Godenschwege, T. A. Whole Mount Preparation of the Adult Drosophila Ventral Nerve Cord for Giant Fiber Dye Injection. J. Vis. Exp. (52), e3080, doi:10.3791/3080 (2011).

View Video