Всего Подготовка горе взрослых Drosophila Брюшной нервной для инъекций Гигантские Dye Волоконно
Summary
<em> В естественных условиях</em> Рассечение взрослых<em> Drosophila</em> Брюшной нервной цепочки (VNC) демонстрируется. Данный метод вскрытия причин незначительный ущерб VNC позволяет последующих маркировки гигантские нейроны волокна с флуоресцентным красителем для высоким разрешением.
Abstract
Для анализа аксонального и дендритные морфологии нейронов, крайне важно получить точную маркировку нейронных структур. Подготовка и помечены образцы с практически нет повреждения тканей позволяет проанализировать морфологии клеток и сравнивать отдельные образцы друг с другом, следовательно, позволяющие идентификацию мутантных аномалий.
В методе вскрытия показали нервной системы остается главным образом внутри взрослой мухи. Через спинной разрез брюшной полости и грудной клетки открыты, и большинство внутренних органов удаляются. Только спинной стороне брюшной нервной цепочки (VNC) и соединительной шейки (CVC), содержащих большое аксоны гигантских волокон (GFS) 1 подвергаются, в то время как мозг с телом Ф. клетки и дендриты остается 2 в нетронутыми голову . В этот препарат наиболее нервы VNC должна оставаться привязаны к своим мышцам.
После вскрытия, внутриклеточные заполнение гигантского волокна (GF) с флуоресцентным красителем демонстрируется. В CVC GF аксонов расположены на спинной поверхности и тем самым могут быть легко визуализированы под микроскопом с дифференциалом интерференционного контраста (DIC) оптики. Это позволяет инъекции аксонов GF с красителем на этом сайте для обозначения всей GF включая аксонов и их терминалов в VNC. Этот метод приводит к надежным и сильным окрашивание GFs позволяет нейронам для включения в образ сразу же после заполнения epifluorescent микроскопом. Кроме того, флуоресцентный сигнал может быть усилен с помощью стандартных процедур иммуногистохимии 3 подходит для высокое разрешение конфокальной микроскопии.
Protocol
Discussion
Нервной системы можно разрезать, не извлекая его из летать тела. Это имеет два преимущества, во-первых, вскрытие причин незначительный ущерб нервной системе, во-вторых, большинство нервов пребывания придает мышц и органов чувств. Выполнение рассечение, как описано, готовит образец для ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Проекта, описанного была поддержана грантом Количество R01HD050725 из Национального института детского здоровья и человеческого развития, TAG содержание несут их авторы и не обязательно отражает официальную точку зрения Национального института детского здоровья и человеческого развития или Национальный институт здоровья. Мы благодарим членов лаборатории Godenschwege а также Барбара Schreader к их участию в рукописи и видео.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Referências
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Boerner, J., Duch, C. Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord. J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity. J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology. J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).
- Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation. Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).
- Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation. J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).
- Storkebaum, E. Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS). Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. , (2011).
