Preparação Monte todo o Adulto Drosophila Cordão nervoso ventral para injeção gigante de fibra Dye
Summary
Um<em> In vivo</em> Dissecção do adulto<em> Drosophila</em> Cordão nervoso ventral (VNC) é demonstrada. Este método de dissecação em particular cause poucos danos ao VNC permitindo a rotulagem subseqüentes dos neurônios fibra gigante com tinta fluorescente para imagens em alta resolução.
Abstract
Para analisar a morfologia axonal e dendríticas dos neurônios, é essencial para obter a rotulagem exacta de estruturas neuronais. Preparação de amostras bem rotulados com pouco ou nenhum dano tecidual nos permite analisar a morfologia das células e comparar amostras individuais entre si, permitindo assim a identificação de anomalias mutantes.
No método de dissecação demonstrou o sistema nervoso permanece na maior parte dentro da mosca adulta. Através de uma incisão dorsal, abdome e tórax são abertas ea maioria dos órgãos internos são removidos. Apenas o lado dorsal da medula nervosa ventral (VNC) e do conjuntivo cervical (CVC), que contém os axônios das fibras grandes gigantes (FG) 1 estão expostos, enquanto o cérebro com o corpo celular e dendritos GF 2 permanece na cabeça intacta . Nesta preparação mais nervos do VNC deve permanecer solidários com os seus músculos.
Após a dissecção, o preenchimento intracelular da fibra gigante (GF) com um corante fluorescente é demonstrada. Na CVC os axônios GF estão localizados na superfície dorsal e, portanto, podem ser facilmente visualizadas em um microscópio com contraste de interferência diferencial (DIC) óptica. Isto permite a injeção de axônios GF com corante neste site para rotular o GF inteiro, incluindo os axônios e os terminais na VNC. Este método resulta em coloração confiável e forte da FG permitindo que os neurônios a ser trabalhada imediatamente após o enchimento com um microscópio de epifluorescência. Alternativamente, o sinal fluorescente pode ser melhorada através de procedimentos imuno-histoquímica padrão de 3 adequado para microscopia confocal de alta resolução.
Protocol
Discussion
O sistema nervoso pode ser dissecada sem extraí-lo do corpo da mosca. Isso tem duas vantagens, primeiro, a dissecção causa pouco dano ao sistema nervoso e, segundo, a maioria dos nervos ficar ligado para os músculos e órgãos sensoriais. Realizar a dissecção, como descrito, prepara a amostra para a frente de corante rotulagem do FG. Convenientemente, os motoneurônios pós-sináptico para o FG ficar ligado para os músculos. Axônios, portanto, não estão danificados, mantendo os neurônios vivos por mais tempo….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O projeto descrito foi apoiada pelo Grant Número R01HD050725 do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano para TAG O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam, necessariamente, a posição oficial do Instituto Nacional de Saúde Infantil e Desenvolvimento Humano ou a National Institutes of Health. Agradecemos a membros do laboratório Godenschwege bem como Schreader Barbara para a sua entrada para o manuscrito e vídeo.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Referências
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