Monte Preparazione tutto il Adulti Drosophila Cordone nervoso ventrale per iniezione Giant Dye Fibra
Summary
Un<em> In vivo</emDissezione> dell'adulto<em> Drosophila</emCordone nervoso> ventrale (VNC) è dimostrata. Questo metodo di dissezione particolare provoca pochi danni alla VNC che permette l'etichettatura successivo dei neuroni fibra gigante con colorante fluorescente per l'imaging ad alta risoluzione.
Abstract
Per analizzare la morfologia assonali e dendritiche dei neuroni è essenziale per ottenere un'accurata etichettatura delle strutture neuronali. Preparazione dei campioni ben etichettati con poco o nessun danno ai tessuti ci permette di analizzare la morfologia cellulare e di confrontare singoli campioni l'uno all'altro, permettendo quindi l'identificazione di anomalie mutante.
Nel metodo dissezione dimostrato il sistema nervoso rimane per lo più all'interno della mosca adulta. Attraverso una incisione dorsale, l'addome e il torace sono aperti e la maggior parte degli organi interni vengono rimossi. Solo il lato dorsale del cordone nervoso ventrale (VNC) e il connettivo cervicale (CVC) contenente gli assoni grande delle fibre giganti (GF) 1 sono esposte, mentre il cervello che contiene il corpo cellulare GF e dendriti rimane 2 in testa intatta . In questa preparazione più nervi of the VNC dovrebbe rimanere attaccati alla loro muscoli.
Dopo la dissezione, il riempimento intracellulare della fibra gigante (GF) con un colorante fluorescente è dimostrata. Nel CVC gli assoni GF si trovano sulla superficie dorsale e quindi possono essere facilmente visualizzati al microscopio con contrasto di interferenza differenziale (DIC) ottica. Questo permette l'iniezione degli assoni GF con colorante in questo sito per etichettare il GF intero compreso gli assoni e la loro terminali nel VNC. Questo metodo si traduce in colorazione affidabile e forte del GF che permette ai neuroni di essere ripreso immediatamente dopo il riempimento con un microscopio epifluorescente. In alternativa, il segnale fluorescente può essere migliorata utilizzando procedure di immunoistochimica standard 3 adatto per la microscopia confocale ad alta risoluzione.
Protocol
Discussion
Il sistema nervoso può essere sezionati senza estrarre dal corpo volare. Questo ha due vantaggi, in primo luogo, la dissezione provoca pochi danni al sistema nervoso, e la seconda, più i nervi per rimanere attaccati i muscoli e gli organi sensoriali. Esecuzione della dissezione, come descritto, si prepara il campione per dritto in avanti tintura di etichettatura del GF. Per comodità, i motoneuroni postsinaptica al GF rimanere attaccati ai muscoli. Assoni, quindi, non sono danneggiati, mantenendo in vita i neuroni pi?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto descritto è stato sostenuto dal Codice di Autorizzazione R01HD050725 dal National Institute of Child Health e lo Sviluppo Umano di TAG Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente la posizione ufficiale del National Institute of Child Health e Sviluppo Umano o il National Institutes of Health. Ringraziamo i membri del laboratorio Godenschwege così come Barbara Schreader per il loro contributo al manoscritto e video.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Referências
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