Ganze Berge Vorbereitung des Adult Drosophila Bauchmark für Giant Fiber Injection Dye
Summary
Ein<em> In vivo</em> Dissektion der erwachsenen<em> Drosophila</em> Bauchmark (VNC) ist bewiesen. Diese besondere Dissektion Methode verursacht kaum Schäden an den VNC ermöglicht die spätere Kennzeichnung des riesigen Faser Neuronen mit Fluoreszenzfarbstoff für hochauflösende Bildgebung.
Abstract
Zur Analyse der axonalen und dendritischen Morphologie von Neuronen, ist es wichtig, die genaue Kennzeichnung von neuronalen Strukturen zu erhalten. Vorbereitung gut markierten Proben mit wenig bis gar keine Gewebeschäden ermöglicht es uns, Zellmorphologie zu analysieren und einzelne Proben miteinander zu vergleichen, so die Möglichkeit, die Identifizierung von Mutanten Anomalien.
In der Sektion zeigte Methode des Nervensystems bleibt meist im Inneren des Erwachsenen fliegen. Durch eine dorsale Inzision, sind der Bauch und Brustkorb geöffnet und die meisten der inneren Organe entfernt werden. Nur die Rückenseite des Bauchmark (VNC) und der Hals-Binde (CVC) mit den großen Axone der riesigen Fasern (GF) 1 ausgesetzt sind, während das Gehirn mit dem GF Zellkörper und Dendriten bleibt 2 in der intakten Kopf . In dieser Vorbereitung die meisten Nerven des VNC sollte, um ihre Muskeln verbunden bleiben.
Nach der Präparation wird die intrazelluläre Befüllung der riesigen Glasfaser (GF) mit einem fluoreszierenden Farbstoff nachgewiesen. In der CVC die GF Axone sind an der dorsalen Oberfläche liegt und somit können leicht sichtbar unter dem Mikroskop mit Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Optik. Dies ermöglicht die Injektion des GF Axone mit Farbstoff an dieser Stelle auf die gesamte GF einschließlich der Axone und ihre Terminals in den VNC-Label. Diese Methode führt zu zuverlässigen und starken Färbung der GF so dass die Neuronen, um sofort nach dem Befüllen mit einer epifluoreszenten Mikroskop abgebildet werden. Alternativ kann die Fluoreszenz-Signal verstärkt mit Standard-Immunhistochemie Verfahren 3 geeignet für hohe Auflösung der konfokalen Mikroskopie werden.
Protocol
Discussion
Das Nervensystem kann ohne es zu extrahieren aus dem Körper fliegen seziert werden. Dies hat zwei Vorteile, erstens, bewirkt, dass die Zergliederung wenig Schaden für das Nervensystem, und zweitens, die meisten Nerven angeschlossen bleiben, um die Muskeln und Sinnesorgane. Durchführen der Dissektion, wie beschrieben, bereitet die Proben für geradlinig Farbstoff-Kennzeichnung der GFS. Günstig, bleiben die Motoneuronen postsynaptischen der GF an die Muskeln. Axone, also unbeschädigt sind, halten die Neuronen länger…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Das beschriebene Projekt wurde von Grant Number R01HD050725 vom National Institute of Child Health and Human Development unterstützt, um TAG Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Meinung des National Institute of Child Health and Human Development oder die National Institutes of Health. Wir danken Mitglieder der Godenschwege Labor sowie Barbara Schreader für ihren Input, um das Manuskript und Video.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Referências
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