Préparation Mont entiers de l'Adulte Drosophile Chaîne nerveuse ventrale pour injection fibre Dye Géant
Summary
Une<em> In vivo</emDissection> de l'adulte<em> Drosophile</emCordon> nerveuse ventrale (VNC) est démontrée. Cette méthode de dissection particulier provoque peu de dégâts à l'VNC permettant l'étiquetage ultérieur de la fibre de neurones géants avec un colorant fluorescent pour l'imagerie haute résolution.
Abstract
Pour analyser la morphologie axonale et dendritique des neurones, il est essentiel d'obtenir un étiquetage précis des structures neuronales. Préparation des échantillons bien étiquetés avec peu ou pas endommager les tissus nous permet d'analyser la morphologie des cellules et de comparer des échantillons individuels les uns aux autres, permettant ainsi l'identification des anomalies mutant.
Dans la méthode de dissection démontré le système nerveux reste le plus souvent à l'intérieur de la mouche adulte. Grâce à une incision dorsale, l'abdomen et le thorax sont ouverts et la plupart des organes internes sont enlevés. Seule la face dorsale de la moelle nerveuse ventrale (VNC) et le connectif cervical (CVC) qui contient les axones des fibres grands géants (GFS) 1 sont exposées, tandis que le cerveau contenant le corps cellulaire et des dendrites GF reste deux dans la tête intacte . Dans cette préparation la plupart des nerfs de la VNC doit rester attachés à leurs muscles.
Après la dissection, le remplissage intracellulaire de la fibre géante (GF) avec un colorant fluorescent est démontrée. Dans le CVC les axones GF sont situés à la surface dorsale et peut donc être facilement visualisés au microscope à contraste d'interférence différentiel (DIC) optique. Cela permet l'injection du colorant axones GF avec ce site à l'étiquette du GF entier, y compris les axones et leurs terminaux dans le VNC. Cette méthode aboutit à coloration solide et fiable de l'ETG permettant aux neurones à imager immédiatement après le remplissage avec un microscope à épifluorescence. Alternativement, le signal fluorescent peut être améliorée en utilisant des procédures standard de 3 immunohistochimie adapté à la microscopie confocale à haute résolution.
Protocol
Discussion
Le système nerveux peut être disséqués sans l'extraire du corps de la mouche. Cela a deux avantages, d'abord, la dissection cause peu de dommages au système nerveux et, deuxièmement, la plupart des nerfs restent attachés à des muscles et des organes sensoriels. Exécution de la dissection, comme décrit, prépare l'échantillon pour simple colorant d'étiquetage de la SFP. Idéalement, les motoneurones postsynaptiques au GFS rester attaché aux muscles. Les axones, par conséquent, ne sont pas en…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le projet décrit a été soutenue par la concession numéro R01HD050725 de l'Institut national de la santé infantile et le développement humain de baliser le contenu est exclusivement la responsabilité de leurs auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues officielles de l'Institut national de la santé infantile et du développement humain ou de la National Institutes of Health. Nous remercions les membres du laboratoire Godenschwege ainsi que Barbara Schreader pour leur contribution au manuscrit et vidéo.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Referências
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