Hele Mount Voorbereiding van de Adult Drosophila Ventraal Nerve Fiber Koord voor Giant Dye Injectie
Summary
Een<em> In vivo</em> Dissectie van de volwassen<em> Drosophila</em> Ventrale zenuw koord (VNC) is aangetoond. Deze bijzondere dissectie methode veroorzaakt weinig schade aan de VNC waardoor de daaropvolgende etikettering van de reus vezel neuronen met fluorescerende kleurstof voor hoge resolutie imaging.
Abstract
Het analyseren van de axonale en dendritische morfologie van neuronen, is het essentieel om het verkrijgen juiste etikettering van neuronale structuren. Goed voorbereid te zijn gelabeld monsters met weinig tot geen beschadiging van het weefsel stelt ons in staat celmorfologie te analyseren en aan de individuele monsters met elkaar te vergelijken, vandaar waardoor de identificatie van mutant afwijkingen.
In de aangetoonde methode dissectie van het zenuwstelsel blijft overwegend binnen de volwassen vlieg. Via een dorsale incisie, de buik en borstkas geopend en het merendeel van de interne organen zijn verwijderd. Alleen de dorsale zijde van de ventrale zenuw snoer (VNC) en de cervicale verbindende (CVC) met de grote axonen van de reus vezels (SBO) 1 worden blootgesteld, terwijl de hersenen met de GF cellichaam en dendrieten blijft 2 in de intacte kop . In deze voorbereiding de meeste zenuwen van de VNC moeten blijven gehecht aan hun spieren.
Na de dissectie, is de intracellulaire vullen van de reus vezel (GF) met een fluorescerende kleurstof gedemonstreerd. In de CVC de GF axonen bevinden zich op het dorsale oppervlak en kan dus eenvoudig worden gevisualiseerd onder een microscoop met differentieel interferentie contrast (DIC) optiek. Hierdoor kan de injectie van de GF axonen met kleurstof op deze site te labelen de gehele GF inclusief de axonen en hun terminals in de VNC. Deze methode resulteert in een betrouwbare en sterke kleuring van de SBO waardoor de neuronen direct worden afgebeeld na het vullen van een epifluorescerende microscoop. Als alternatief kan het fluorescerende signaal worden verbeterd met behulp van standaard immunohistochemie procedures 3 geschikt voor hoge resolutie confocale microscopie.
Protocol
Discussion
Het zenuwstelsel kan worden ontleed zonder extraheren uit de vlieg lichaam. Dit heeft twee voordelen, ten eerste de dissectie veroorzaakt weinig schade aan het zenuwstelsel, en ten tweede, de meeste zenuwen aangesloten blijven op de spieren en de zintuigen. Het uitvoeren van de dissectie, zoals beschreven, bereidt het monster voor rechttoe rechtaan dye-etikettering van de SBO. Handig is dat de motoneuronen postsynaptische om de GFS aangesloten blijven op de spieren. Axonen, dus onbeschadigd zijn, houden van de neuronen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het beschreven project werd ondersteund door Grant nummer R01HD050725 van het National Institute of Child Health and Human Development aan TAG De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en niet noodzakelijkerwijs het officiële standpunt van het National Institute of Child Health and Human Development of de National Institutes of Health. Wij danken de leden van de Godenschwege lab als Barbara Schreader voor hun inbreng aan het manuscript en video.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Referências
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Boerner, J., Duch, C. Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord. J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity. J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology. J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).
- Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation. Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).
- Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation. J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).
- Storkebaum, E. Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS). Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. , (2011).
