הר הכנה שלמים של המבוגר תסיסנית עצבי חוט הגחון עבור הזרקת סיבים ענק דיי
Summary
<em> In vivo</em> דיסקציה של המבוגר<em> תסיסנית</em> העצב הגחוני (VNC) הוא הוכיח. שיטה זו לנתיחה מסוים גורם נזק קטן של VNC המאפשר תיוג הבאים של נוירונים סיב ענק עם צבע פלואורסצנטי עבור הדמיה ברזולוציה גבוהה.
Abstract
כדי לנתח את המורפולוגיה axonal ו הדנדריטים של נוירונים, זה הכרחי כדי לקבל תיוג מדויק של מבנים עצביים. הכנת דוגמאות שכותרתו היטב עם מעט שום נזק לרקמות מאפשרת לנו לנתח מורפולוגיה תאים להשוות דגימות בודדות זה לזה, ולכן מאפשרת זיהוי של אנומליות מוטציה.
בשיטה לנתיחה הפגינו את מערכת העצבים נשאר בעיקר בתוך הזבוב הבוגר. דרך חתך הגב, הבטן החזה נפתחים ואת רוב האיברים הפנימיים יוסרו. רק בצד הגבי של חוט העצב הגחוני (VNC) ואת החיבור צוואר הרחם (CVC) המכיל את האקסונים גדולה של סיבי ענק (GFS) 1 חשופים, בעוד המוח המכיל את גוף התא GF ו נשאר דנדריטים 2 בראש שלם . בהכנה זו רוב העצבים של VNC צריך להישאר מחוברים השרירים שלהם.
בעקבות לנתיחה, ממלאים את תאיים של סיבים הענק (GF) עם פלורסנט לצבוע מודגם. ב CVC האקסונים GF ממוקמות על פני השטח הגבי, ולכן ניתן דמיינו בקלות תחת מיקרוסקופ עם ניגודיות ההפרש התערבות (DIC) אופטיקה. זה מאפשר הזרקה של אקסונים GF עם צבע באתר זה לתווית GF כולו כולל אקסונים ומסופי שלהם VNC. שיטה זו גורמת מכתים אמין וחזק של GFS המאפשר הנוירונים להיות צילמו מיד לאחר מילוי עם מיקרוסקופ epifluorescent. לחלופין, האות ניאון ניתן לשפר באמצעות נהלים אימונוהיסטוכימיה תקן 3 מתאים מיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה confocal.
Protocol
Discussion
מערכת העצבים יכולה להיות גזור ללא חילוץ אותו מהגוף לעוף. זו שני יתרונות, הראשון, דיסקציה גורמת נזק מועט במערכת העצבים, ושנית, עצבים ביותר להישאר מחוברים אל השרירים ואיברי חישה. ביצוע הנתיחה, כפי שתואר, מכין את המדגם עבור ישר תיוג, צבע לפנים של GFS. נוח, motoneurons postsynaptic של GFS ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
הפרויקט מתואר נתמכה על ידי מספר גרנט R01HD050725 מהמכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם לתייג התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם או המכונים הלאומיים לבריאות. אנו מודים לחברי במעבדה Godenschwege כמו גם ברברה Schreader עבור קלט שלהם כתב היד ווידאו.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
|---|---|---|---|
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Dissection Microscope | AmScope | SM-2TZ | |
| Vannas Scissors Superfine | Academic Instruments | VS1023 | |
| Dumont Forceps Dumontstar 55 | Fine Science Tools | 11295-51 | |
| Austerlitz Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | Ø 0.1mm |
| Borosilicate Glass Electrodes | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
| Vertical Pipette Puller 700c | David Kopf Instruments | Model 700C | |
| Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma | L0259 | 1% in H2O |
| Fixed Stage Upright Microscope & Camera | Nikon | FN-1 & DS-U2 Camera | |
| Plan Fluor 10X Air Objective | Nikon | CFI Plan Fluor 10X NA 0.3 WD 16mm | |
| Fluor 40X water dipping Objective | Nikon | CFI Fluor 40X W NA 0.80 WD 2.0mm | |
| 3D hydraulic Micromanipulator | Narishige International | Model MW0-3 | |
| Amplifier | Getting Instruments, Inc. | Model 5A |
Referências
- Power, M. E. The thoracico-abdominal nervous system of an adult insect Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 88, 347-409 (1948).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, T. A., Phelan, P. Making an escape: development and function of the Drosophila giant fibre system. Semin. Cell Dev. Biol. 17, 31-41 (2006).
- Boerner, J., Duch, C. Average shape standard atlas for the adult Drosophila ventral nerve cord. J. Comp. Neurol. 518, 2437-2455 (2010).
- Gu, H., O’Dowd, D. K. Cholinergic synaptic transmission in adult Drosophila Kenyon cells in sity. J. Neurosci. 26, 265-272 (2006).
- Boerner, J., Godenschwege, T. A. Application for the Drosophila ventral nerve cord standard in neuronal circuit reconstruction and in-depth analysis of mutant morphology. J. Neurogent. 24, 158-1567 (2010).
- Godenschwege, T. A., Kristiansen, L. V., Uthaman, S. B., Hortsch, M., Murphey, R. K. A conderved role for Drosophila Neuroglian and human L1-CAM in central-synapse formation. Curr. Biol. 16, 12-23 (2006).
- Uthaman, S. B., Godenschwege, T. A., Murphey, R. K. A mechanism distinct from highwire for the Drosophila ubiquitin conjugase bendless in synaptic growth and maturation. J. Neurosci. 28, 8615-8623 (2008).
- Storkebaum, E. Dominant mutations in the tyrosyl-tRNA synthetase gene recapitulate in Drosophila features of human Charcot-Marie-Tooth neuropathy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106, 11782-11787 (2009).
- Allen, M. J., Godenschwege, T. A. Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFS). Cold Spring Harb. Protoc. 2010, pdb.prot5453-pdb.prot5453 (2010).
- Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster. J. Vis. Exp. , (2011).
