1. התא המארח transfection Seed 2 x 10 6 CHO-DXB11 תאים T75 בקבוק תא קורנינג תרבות במדיום הגידול 15 מ"ל (MEMa עם נוקלאוטידים ו נוקלאוזידים (Gibco, מספר קטלוג 12,571) בתוספת 10% γ-מוקרן מאופיין בסרום שור העובר (cFBS) (HyClone, מספר קטלוג SH30071.03) ו 10 mL / L של תמיסת גלוקוז 45% (Sigma, מספר קטלוג G8769)) יום אחד לפני transfection. בזמן transfection, להכין מתחמי transfection כדלקמן: מדולל 8 DNA מיקרוגרם ב 800 μl של מדיום הגידול ללא נסיוב בצינור microcentrifuge סטרילית. מערבבים בעדינות. מדולל 40 Lipofectamine μl ™ (Invitrogen 18324012) בשנת 800 μl של מדיום הגידול ללא נסיוב בצינור קלקר. מוסיפים את ה-DNA מדולל ל ™ Lipofectamine בדילול מלא. מערבבים בעדינות דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את מדיום הגידול של התאים T75 ולהחליף עם 6.4 מ"ל של מדיום גידול ללא נסיוב. מוסיפים 1.6 מ"ל של קומפלקסים transfection אל הבקבוק. מערבבים בעדינות על ידי נדנדה את הצלחת. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 6 שעות. הוסף 8 מ"ל של מדיום הגידול כדי הבקבוק ואת לדגור על 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך הלילה. הסר בינוני על ידי שאיפה ולהוסיף בינוני צמיחה טריים הבקבוק. דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך הלילה. החלף את מדיום הגידול עם מבחר בינוני (מדיום MEMa ללא נוקלאוטידים או נוקלאוזידים (Gibco, מספר קטלוג 12,561) בתוספת 10% γ-מוקרן dialyzed בסרום שור העובר (dFBS) (HyClone, מספר קטלוג SH30079.03) ו – 10 mL / L 45 פתרון% גלוקוז (Sigma, מספר קטלוג G8769)). דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס CO 2 באינקובטור במשך 2-3 שבועות. 2. שיבוט על ידי cytometry מיון תזרים תא פעיל לסלק תאים מהבקבוק ו צנטריפוגות בסל"ד 800 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend התאים בינוני מבחר בתוספת 2% שור נוגדנים בסרום אלבומין ו שכותרתו fluorescently IgG נגד אדם בדילול 01:20. לדגור על הקרח במשך 15-30 דקות ולאחר מכן לשטוף פעמיים עם PBS קר. Resuspend תאים 1x PBS בתוך צינור פוליפרופילן. היכונו סוג aseptic על FACSAria BD ™. הכן 96-היטב בתא תרבות צלחת המכילה 200 בינוני מבחר μl היטב כל אחד. בסביבה נקייה מחיידקים, לטעון את הצינור עם תאים ולנתח על BD FACSAria ™, לרשום את התוצאות עבור תאים מוכתמת בלא כתם, בהתאמה. הגדר את השערים והגדרות כדי למיין תאים בודדים של הפרופיל הרצוי מכתים הקרינה לתוך צלחת-96 טוב (ים). תאים transfected מנותחים הראשון המבוסס על פיזור קדימה לעומת פיזור לוואי. השער של תאים חיים עשויה מבוסס על פיזור קדימה, אשר מודד גודל של התא, ולפזר הצד, אשר מודד את המורכבות של התא או גרעיניות. התאים שנמצאים בתוך השער הזה נבחנים אז על מכתים PE. שער PE שלילי מוגדר עבור תאים transfected בלא כתם או תאים לארח מוכתם. כמו תאים transfected מוכתם נבדקות על ידי FACS, "High PE" שער מותווה אז להקיף את 5% העליונים של כל התאים חיובית מכתים PE. דגירה צלחות 37 ° C בחממה במשך שבועיים. 3. תיעוד של היווצרות המושבה ידי CloneSelect ™ Imager המושבה מסמך היווצרות ב 96-היטב הצלחות על CloneSelect Imager ™ ב 0 יום, יום 3, יום 7 ויום 13 FACS לאחר מיון. התיעוד תמונה יבטיח מבחר של שיבוטים שמקורם בתא יחיד. שלב קריטי בתיעוד זה הוא מקבל את מישור המוקד מותאם כראוי למדידת היום 0, שכן יש רק תא אחד טוב כל בנקודה הזאת. חשוב מאוד כי התמונות של אלו תאים בודדים נמצאים להתמקד בניסיון להתאים את להתמקד בהם יכול להיות מטעה במקרה הטוב. המטוס המוקד יכול להשתנות משמעותית בין המותגים של צלחות, ואולי אפילו הרבה הרבה המותג אותו. לפיכך מטוס מראש מוקד צריך להיות בשימוש. ניתן להשיג זאת על ידי התמקדות מבחן מיקרו חרוזים או תאים צפיפות גבוהה שהופקדו על צלחות ממגרש אותו בשימוש. לחלופין, צלחות בוגרת ממגרש אותו עשוי לשמש למטרה זו. לאחר FACS מיון, חשוב גם לתת התאים להתפשר על מינימום של 2 שעות לפני הדמיה, כך שהם יהיו "קבועים" בעמדה על הצלחת. 4. הקרנת הסרט ואת הבחירה של שיבוטים פרודוקטיבי מדגם מסמך עמדה על 96-היטב צלחות קבלת assay. העברת aliquots של supernatant 20 μl (לדלל במידת הצורך) תוך 96-assay גם צלחות של חופש נץקאן EVO ® מערכת טיפול נוזלי. רובוט זה גמיש המסוגלפלטפורמה IC הותאם זו תרבות אחרת אוטומטיות לעבוד התא. תוכניות מיוחדות נכתבו הטובה ביותר לנצל ולשפר את יכולות EVO חופש רובוטית לפיתוח קו התא. דוגמה לכך היא הגדרת נץקאן לפרש CloneSelect ™ נתונים Imager הדגימה בארות עם מושבות אחת. תוכניות אחרות נדרשו לבצע משימות נוספות תרבית תאים כגון להפוך את דילולים המתאימה של דגימות שנלקחו, לפרש, קטלוג וצלחות מדגם מסומן באופן ידני אם נדרש, בהיקף של עד שיבוטים ייצור גבוהה, וכו 'רבים של תוכניות אלה ניתן בקלות מוחל על 384 צלחות היטב, כמו גם את הפורמט המקורי 96 היטב. ייצור נוגדנים בדגימות מנותח על ידי כריך לנוגדנים אנושיים גילוי ELISA (פירס, Rockford, IL) על חופש נץקאן EVO ® מערכת טיפול נוזלי. דוגמאות סטנדרטיות (האדם מיאלומה IgG1, קאפה) (Sigma, סנט לואיס, מיזורי) הועמסו על טרום מצופה ביו Anti-Human מעיל צלחות Assay IgG (BD Biosciences, בסן חוזה, קליפורניה). הצלחות הודגרו בטמפרטורת החדר למשך שעתיים ואחריו שלושה שוטף PBS. עיזים ImmunoPure Anti-Human IgG, (FC-gamma)-HRP (פירס, Rockford, IL) נוספה צלחת בדילול 1:2000 וטופחו במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. צלחות נשטפו שלוש פעמים עם PBS לפני הוספת ABTS המצע (פירס, Rockford, IL) ו הוקראו על הקורא צלחת באמצעות ספיגת ב 405 ננומטר לצורך זיהוי. בחר שיבוטים פרודוקטיבי ולהעריך את הפרודוקטיביות בתרבות ההשעיה. במשך תרבות האכילה אצווה, התאים היו מחוסן ב 0.3X106 תאים / מ"ל חלבון חינם יתרונות המדיום JRH מיידי 65,578 (SAFC Biosciences, Lenexa, KS) בתוספת 5 g / L סויה hydrolyzate (משרד הרישוי הבינלאומי, מספר קטלוג SE50MAF-UF, הרבה מספר) ו מודגרות ב 37 ° C עם 7.5% CO 2. תרבות נמשך נוספו עם 2 g / L גלוקוז (Sigma, מספר קטלוג G8769, מספר הרבה 098K2329) כאשר גלוקוז בתוספת ריכוז חומצת החלב בתרבות הגיע למטה 2 g / L, והאכילה 2 מ"מ גלוטמין (Gibco, מספר קטלוג 25030, מספר רב 568177) כאשר רמות הגלוטמין הגיע מתחת 200 מ"ג / ליטר (מטבוליטים נמדד על ידי YSI Bioanalyzer). הפד אצווה תרבויות הופסקה ביום 14 ייצור נוגדנים נמדדה על ידי הפוכה שלב HPLC. אפיון גנטי של שיבוטים מועמד על ידי הקרינה הכלאה באתרו (FISH) 5. 5. נציג תוצאות: דוגמה לפתח נוגדנים לייצר שיבוטים עם שיטת תפוקה גבוהה מוצג באיור 1 ואיור 2. בריכת תא transfected היה מוכתם נוגדן שכותרתו fluorescently IgG נגד אדם (איור 1 א), נותחו מיון על BD FACSAria ™ (איור 1B). הקמת המושבה בצלחת 96-גם היה צילמו על CloneSelect Imager ™ (תרשים 1C). תרבות supernatant Cell נדגמה מבארות המכילים מושבת יחיד assayed ידי ELISA על מערכת החירות נץקאן ® EVO טיפול נוזלי (1D איור). שיבוטים פרודוקטיבי נמצאו מתאי כי הפגינו רמה גבוהה יותר נוגדנים השטח לידי ביטוי מכתים עם פלורסנט התווית נגד לנוגדנים אנושיים. כאשר משווים שיבוטים שנוצרו שתי אוכלוסיות של הבריכה התא הראשוני transfected, הבדל עצום בפריון ב-נמאס אצווה תרבות נצפתה (איור 2). במשך שני שיבוטים העליון שנוצר מן האוכלוסייה תא עם הביטוי נוגדנים גבוהה פני השטח (PE גבוהה), את הפרודוקטיביות ספציפי נע בין 50-70 pg / תא / יום. בעוד התפוקה נוגדן היה ~ 20 pg / תא / יום שני שיבוטים העליון שנוצר מן האוכלוסייה תא עם הביטוי נוגדנים נמוך משטח (PE נמוך). יתר על כן, שורות תאים שפותחו על ידי מיון FACS יציבים יותר לגבי ייצור נוגדנים מאשר אלו שהיו משובט באמצעות דילול צביעה ידנית (איור 3A). פריון ספציפיים של שיבוט העליונה, ירדו "Clone 1", שנוצר על ידי דילול צביעה ידנית מ ~ 30 ל ~ 10 PCD PCD לאחר culturing עבור 80 הכפלות התא. מצד שני, את subclone העליון שנוצר על ידי FACS מיון, "שיבוט 2", הצליח לשמור על פרודוקטיביות ספציפי סביב PCD 20 לפחות 100 הכפלות התא. על ידי ניאון הכלאה באתרו (FISH), הפגנו Clone 1 הראה כאוכלוסייה מעורבת של הפנוטיפ (85%) לבין פנוטיפ B (15%). לעומת זאת, FACS מיון שיבוט (שיבוט 2) הראתה להיות אוכלוסייה הומוגנית יותר, עם 99.5% של התאים התבררה הפנוטיפ (איור 3B). באיור 1. ופיתוח של תא קווי ייצור לייצור נוגדנים חד שבטיים מתאי CHO. א) משטח מכתים הבריכה הראשונית תא transfected עם נוגדן שכותרתו fluorescently IgG נגד האדם. ב) מיון של האוכלוסייה תא עם עוצמת הקרינה גבוהה (PE גבוה) ואת עוצמת הקרינה נמוכה (PE נמוך) לתוך צלחת 96-היטב. ג) תיעוד המושבהמיום היווצרות 0 עד 13 יום שלאחר זריעת על CloneSelect Imager ™. ד) על ידי הקרנת שיבוטים ELISA. איור 2. הקשורים Surface רמת נוגדנים בקורלציה עם פריון הנוגדן של התא. המשובטים עם מכתים פלורסנט גבוהים ונמוכים היו שניהם התפתח שורות תאים ומוערכת בתרבות האכילה אצווה. נפחית titer ופריון ספציפי הושוו בין 2 שיבוטים העליון של כל האוכלוסייה. איור 3. המשובטים שנוצר FACS מיון התערוכה הומוגניות גנטית גבוהה ויציבות לשבט. א) ייצור נוגדנים יציבות בתרבות אצווה ~ 80 הכפלות התא הזמן לחלוף תרבות. Δ, לשבט נוצר באמצעות דילול מגבילים, שבו התאים היו זורעים ב 2000 תאים / היטב, 1000 תאים / היטב 500 תאים / היטב. , לשבט נוצר באמצעות FACS בתא 1 / היטב. ב) אתר transgene אינטגרציה בכרומוזום התא CHO מזוהה על ידי ניאון הכלאה באתרה.