1。 HLA – A2 – IG制作，基于AAPC 准备无菌硼酸盐缓冲液硼酸在水中溶解，使0.1M。调整pH至7.0。 通过0.22μm的无菌过滤和储存过滤4 ° C。 准备无菌珠洗涤液以956毫升PBS W / O型的镁或钙。 添加30毫升人AB血清。 添加EDTA的2MM终浓度。 0.1gsodium叠氮化物。 通过0.22μm的无菌过滤和储存过滤4 ° C。 从Invitrogen公司的M – 450环氧珠1毫升股票，约400万珠（珠可以通过血球计数），并放入无菌，螺杆顶部的玻璃小瓶。 把小瓶针对DYNAL磁铁MPC – 1，而珠坚持一侧小瓶，除去吸上清液。一次洗珠，硼酸盐缓冲液1毫升。 为1ml硼酸缓冲液HLA – A2免疫球蛋白二聚体的抗人CD28单克隆抗体（克隆9.3）和20微克和20微克的混合物悬浮珠。 蛋白质珠共轭：上肩的玻璃小瓶和旋转4 ° 24小时。 MPC – 1磁铁放置在管，并删除所有的硼酸盐缓冲。 珠用1ml洗涤液洗磁珠两次。 孵育1毫升珠洗涤液珠，旋转4 ° 24小时。由于珠洗涤液中含有人AB血清，它会阻止所有剩余的蛋白结合位点上的珠子。 从玻璃小瓶中取出上清液，用1ml新鲜珠洗涤液取代。 2。 AAPC肽加载，存储的质量控制 〜5 × 10 5珠添加100μL流式细胞仪，流式细胞仪管清洗缓冲和染色加入1μl抗鼠IgG1 – PE（识别的HLA – A2免疫球蛋白的Fc部分）和抗鼠IgG2a – FITC加入1μl（承认抗CD28单克隆抗体的Fc部分）。染色洗涤液的流式细胞仪20分钟后，洗一遍，并宣读染色结果立即用流式细胞仪（图4）。 肽加载到珠：玻璃小瓶用1ml无菌PBS洗两次珠。用1ml无菌PBS重悬，然后加入加入10μl的CMV肽（1mg/ml的） 通过血球计数珠，标签的日期和浓度的小瓶。 AAPC使用后至少3天肽的潜伏期在4 ° C，准备允许有足够的时间到HLA – A2免疫球蛋白二聚体肽结合。珠可以被保存在4 ° C，并保持至少6个月的功能。 3。人类的CTL隔离收集来自健康的HLA – A2阳性捐助10 BD肝素钠真空采血管管〜新鲜的外周血百毫升。使用了21号针头或更大，以防止溶血。 在室温下离心10分钟，在300xg 小心地取出吸顶级的等离子层。血浆可以用来作为补充培养基。 替换用无菌PBS收集的血浆和血液转移到无菌的T75培养瓶或锥形管50毫升。用PBS的血液充分混合，上下吹打起来。 一旦所有的血液收集，准备4个额外的50毫升锥形管和加入聚蔗糖 – 帕确加15毫升。 慢慢地覆盖3035毫升上方聚蔗糖各管血细胞。接口之间的聚蔗糖和血细胞明显。 在500xg离心机在室温下20分钟。打开刹车“关闭”和加速度尽可能低，以保持层与层之间的界面清晰。 使用seriological吸管，小心吸外周血单个核细胞层，并收集到一个新的50ml的锥形管的PBMC中。当所有PBMC的收获添加400xg PBS和自旋30毫升10分钟。丢弃的上清，用PBS30毫升更多的时间来删除所有剩余的聚蔗糖。 通过美天旎人力，CD8 + T细胞分离试剂盒，根据制造商的协议进行的CD8 + T细胞的分离。该试剂盒的高度丰富CD8 +细胞（通常> 95％）消耗CD8 -细胞。 CD8 + T细胞计数。预期的纯度应大于95％。为了证实这一点使用2 × 10 5细胞和执行CD4/3/8流式细胞仪分析。其余的CTL可以马上使用抗原特异性AAPC刺激，也可以冻结供日后使用。 在体外 AAPC为基础的文化系统4。 准备培养基为TF（T细胞生长因子，在实验室4）2X的培养基：完全RPMI中加5％自体血浆和8％的T细胞生长因子的捐助。 <li>捐助者的自体血浆可以代替人AB血清热灭活。 悬浮1万TF 2X培养液中加完全RPMI培养基8毫升8毫升的CTL，加1 × 10 6 AAPC，拌匀。 到96 ü底部组织培养板，使用多渠道pipetter板细胞。 （每孔160μL） 培养细胞在37℃，5％的CO 2 incubater 7天。第4天与80μL/ TF 2X中等饲料细胞。 细胞是准备7天收获。收获后，将细胞对磁铁，并删除旧的AAPC。 抗原特异性，可根据制造商的协议，由四聚体染色。根据我们以前的研究3表型染色和细胞内细胞因子染色。 replated提取的干细胞可以在相同条件下与AAPC再次。反复刺激后预计将增加细胞数量和抗原特异性。 5。代表性的成果： AAPC后HLA A2 – IG和抗CD28的共轭的例子如图4所示。成功的蛋白共轭是显而易见的，由相应的抗体染色的明显转变。虽然外周血中的巨细胞病毒特异性CTL的频率通常是0.5-1％的AAPC介导的刺激单周后，特异性可以达到55 – 93％（图2和3）。抗原特异性CTL的扩张可以是非常不同的捐助者之间的变量，但结果是在同一捐助重现。扩大巨细胞病毒特异性细胞可以推断，数千倍，易制毒化学水平直接体外（数据未显示） 。细胞内细胞因子染色（图3）表明，这些扩大的CTL官能，而不是消耗殆尽，经过长时间的细胞培养和显着增生。 图1代表AAPC基于前人类CTL的体外扩增流在异体造血干细胞移植的过继免疫治疗的图表 图2代表四聚体染色结果AAPC产生一个文化周后巨细胞病毒特异性的CTL 图3。代表AAPC产生的巨细胞病毒特异性的CTL细胞内细胞因子染色结果细胞病毒（CMV特异性为61％ ） 蛋白共轭抗鼠IgG1 – PE和抗鼠IgG2的- FITC染色后的M – 450环氧珠代表染色结果图4。