1。作り、HLA – A2 – IgをベースaAPC 滅菌ホウ酸緩衝液を準備する 0.1Mを作るために水にホウ酸を溶かす。 pHを7.0に調整する。 4で0.22μm滅菌フィルターや店舗をフィルタ℃に滅菌ビーズ洗浄バッファーを準備します。 956ミリリットルPBS W / Oマグネシウムやカルシウムを取る。 30ミリリットルのヒトAB血清を追加。 EDTA 2mMの最終濃度を追加。 0.1gsodiumアジを追加。 4で0.22μmの滅菌フィルターや店舗をフィルタ℃に 、在庫から約4億ビーズ（ビーズは、血球計数器でカウントすることができます）インビトロジェンM – 450エポキシビーズを1mlを取り、滅菌、スクリュートップガラスバイアルに入れ。 ビーズは、バイアルの側面に付着しながら、DYNAL磁石MPC – 1に対するバイアルを入れ、吸引して上清を取り除く。ホウ酸緩衝液を1mlで一回ビーズを洗浄する。 1ミリリットルホウ酸緩衝液およびHLA – A2 – Igの二量体と抗ヒトCD28モノクローナル抗体（クローン9.3）の20μgの20μgの混合物でビーズを再懸濁します。 ビーズ共役への蛋白質：ローテーター上のガラスバイアルを入れ、4℃で回転℃で24時間。 MPC – 1マグネットにチューブを置き、すべてのホウ酸緩衝液を取り除く。 1ミリリットルビーズ洗浄バッファーで2回ビーズを洗浄してください。 1ミリリットルビーズ洗浄バッファーでビーズをインキュベートし、4℃で回転させる℃で24時間。ビーズ洗浄バッファーは、ヒトAB血清が含まれているので、それは、ビーズ上のすべての残留タンパク質結合部位をブロックします。 ガラス瓶から上清を除去する、1mlの新鮮なビーズの洗浄緩衝液で置き換えてください。 2。 aAPCとペプチド負荷、ストレージの品質管理 FACSチューブに洗浄液100μlのFACSへ〜5 × 10 5ビーズを追加し、抗マウスIgG1 – PE（HLA – A2 – IgのFc部分を認識）および抗マウスIgG2a – FITC（認識1μlの1μlのと染色抗CD28モノクローナル抗体のFc部分）。洗浄バッファーFACSで20分間染色した後、再び洗浄し、フローサイトメーター（図4）によってすぐに染色の結果をお読みください。 ビーズ上にペプチド負荷：1ミリリットル滅菌PBSでガラスバイアルに二回ビーズを洗浄する。 1ミリリットル滅菌PBSで再懸濁しは、CMVペプチド​​（1mg/ml）の10μlを加える血球計算盤によるビーズをカウントし、日付と濃度とのバイアルにラベルを付けます。 aAPCは、HLA – A2 -グロブリン二量体の上にペプチド結合の十分な時間を確保するために、4℃で少なくとも3日後にペプチドインキュベーション使用するための準備が整いました。ビーズは4℃で保存され、少なくとも6ヶ月は継続することができます。 3。人間のCTLの分離 10 BDのヘパリンナトリウムバキュテイナ管に健康的なHLA – A2陽性ドナーからの新鮮な末梢血の〜100ミリリットルを収集する。 21ゲージ針または溶血を防ぐために、大きい方を使用してください。 室温で10分間300xgで遠心分離慎重に吸引して上部のプラズマレイヤーを削除します。プラズマは、培地のためのサプリメントとして使用することができます。 滅菌PBSで収集した血漿を交換し、滅菌T75培養フラスコまたは50ミリリットルコニカルチューブに血液を移す。上下にピペッティングによりよくPBSで血を混ぜる。 一度、すべての血液が収集され、4つの追加50ミリリットルコニカルチューブを準備し、をFicoll – Paqueプラスの15ミリリットルを追加します。 ゆっくりオーバーレイ各チューブのフィコールの上に血液細胞の30〜35ミリリットル。フィコールと血液細胞との間のインターフェースが異なるしてください。 室温で20分間500xgで遠心分離します。ブレーキ"オフ"と層の間に明確なインタフェースを維持するために可能な限り低加速を回します。 seriologicalピペットを使用して、慎重にPBMC層を吸引し、新鮮な50ミリリットルコニカルチューブにPBMCを収集する。すべてのPBMCを10分間400xgでPBSとスピンの30ミリリットルを追加収穫されている場合。上清を捨て、すべての残留フィコールを削除するには、30ミリリットルのPBSでもう一度洗浄する。 製造業者のプロトコルに従ってミルテニーヒトCD8 + T Cellアイソレーションキットを使用することによりCD8 + T細胞の分離に進みます。細胞-このキットは非常に（通常> 95％）CD8を枯渇させることによりCD8 +細胞のために豊かに。 CD8 + T細胞を数える。予想される純度は95％以上でなければなりません。この使用2 × 10 5細胞を確認し、CD4/3/8 FACS解析を実行する。残りのCTLは、どちらの抗原特異的aAPC刺激に対してすぐに使用することも、将来使用するために凍結することができます。 （4） 体外 aAPCベースの培養系で 培地を準備完全RPMI培地に加え、プラズマ、8％のT細胞増殖因子自家5％のドナー：TF（ラボ4で作られたT細胞増殖因子、）2X培地用。 <li>ドナー自己血漿は、熱不活化ヒトAB血清で置換することができる。 再懸 ​​濁し、完全RPMI培地中のTF 2X培地を加えた8ミリリットルの8ミリリットルで100万CTLは、1を追加× 10 6 aAPCを、よく混ぜる。 96ウェルU底の組織培養プレート上にプレートの細胞へのマルチチャンネルピペッターを使用してください。 （ウェルあたり160μlを） 37培養細胞° C、7日間、5％CO 2 incubater。 80μlの/ウェルTF 2X培地で4日目に細胞を養う。 細胞は7日目に収穫する準備が整いました。収穫後は、磁石から細胞を配置し、古いaAPCを取り外します。 抗原特異性は、製造業者のプロトコルに従ってテトラマー染色により決定することができる。表現型の染色と細胞内サイトカイン染色は、私たちの以前の研究の3に従って実行されます。 収穫された細胞は、同じ条件の下で再びaAPCと色を保ち続けることができます。細胞数や抗原特異性は、反復刺激後に増加すると予想される。 5。代表的な結果： HLA A2 – Igおよび抗CD28接合後のaAPCの例を図4に示されています。成功したタンパク質コンジュゲーションは、対応する抗体染色の明確なシフトによって明らかである。末梢血中のCMV特異的CTLの頻度がaAPCを介した刺激の単週後に、通常は0.5から1パーセントですが、特異度は55に到達することができます – 93％（図2および3）。抗原特異的CTLの拡張は、さまざまなドナーの間で非常に可変することができますが、結果は同じドナー内で再現可能です。外挿によって、CMV特異的細胞の拡大は、前駆体のレベルを直接ex vivoで （データは示さず）に比べて倍の数千になることができます。細胞内サイトカイン染色（図3）これらの拡張されたCTLは、長期細胞培養と有意な増殖の後、多官能性ではなく、疲れていることを示しています。 図1。同種HSCTにおける養子免疫療法のためのヒトCTLのaAPCベースのex vivoでの展開の代表的なフローチャート文化の一週間後にaAPCによって生成されたCMV特異的CTLの図2。代表テトラマー染色の結果 図3。aAPCによって生成されたCMV特異的CTLの代表的な細胞内サイトカイン染色の結果（CMV特異性は61％であった） 図4 M – 450エポキシビーズの代表的な染色の結果抗マウスIgG1 – PEと抗マウスIgG2の- FITCで染色したタンパク質コンジュゲーション後の