Estrazione DNA da materiale in paraffina per le analisi genetiche ed epigenetiche
Summary
Questo video dimostra il protocollo per l'estrazione del DNA da fissati in formalina materiale in paraffina. Questa è una di più giorni procedura di sezioni di tessuto in cui sono deparaffinate con xilene, reidratato con etanolo e trattati con proteinasi K per purificare e isolare il DNA per le successive analisi del gene-specifici o genoma.
Abstract
Sviluppo e la progressione della malattia sono caratterizzate da frequenti aberrazioni genetiche ed epigenetiche tra riarrangiamenti cromosomici, gli utili e le perdite numero di copie e la metilazione del DNA. I progressi nella high-throughput, genome-wide tecnologie di profilazione, quali microarray, hanno notevolmente migliorato la nostra capacità di identificare e rilevare queste alterazioni specifiche. Tuttavia, come la tecnologia continua a migliorare, un fattore limitante rimane la qualità del campione e la disponibilità. Inoltre, il follow-up i dati clinici ed esito della malattia sono spesso raccolti anni dopo la raccolta del campione iniziale. I campioni, tipicamente fissati in formalina e paraffina (FFPE), sono conservati in archivi ospedale per gli anni a decenni. DNA può essere efficiente ed efficace recuperato da campioni inclusi in paraffina, se il metodo appropriato di estrazione è applicata. DNA di alta qualità estratto da campioni correttamente conservati e archiviati in grado di supportare analisi quantitative per il confronto di tessuti sani e malati e la generazione di firme genetiche ed epigenetiche 1. Per estrarre il DNA da campioni inclusi in paraffina, nuclei di tessuto o tessuto microdissezionate sono sottoposti a un trattamento xilene, che dissolve la paraffina dal tessuto, e poi reidratato con una serie di lavaggi etanolo. Proteine ed enzimi dannosi come nucleasi sono successivamente digeriti dalle proteinasi K. L'aggiunta di tampone di lisi, che contiene agenti denaturanti come dodecil solfato di sodio (SDS), facilita la digestione 2. Gli acidi nucleici sono purificati dal lisato tessuto utilizzando tampone saturi centrifugazione ad alta velocità fenolo e che genera una soluzione bifasica. DNA e RNA rimane nella fase acquosa superiore, mentre le proteine, lipidi e polisaccaridi sono sequestrate in inter-e organico-fasi, rispettivamente. Ritenzione della fase acquosa e ripetuto fenolo genera un campione pulito. A seguito di fenolo, RNasi A è aggiunto per eliminare l'RNA contaminanti. Ulteriori fenolo dopo incubazione con RNase A sono usati per rimuovere qualsiasi enzima rimanenti. L'aggiunta di acetato di sodio e il DNA isopropanolo precipita, e la centrifugazione ad alta velocità è usato per far sedimentare il DNA e facilitare la rimozione isopropanolo. Sali in eccesso derivanti dal precipitazioni possono interferire con le successive saggi enzimatici, ma possono essere rimosse dal DNA di lavaggio con etanolo al 70%, seguita da centrifugazione di ri-pellet il DNA 3. Il DNA è risospeso in acqua distillata o il buffer di scelta, quantificati e conservati a -20 ° C. DNA purificato può essere successivamente utilizzato in applicazioni a valle che includono, ma non sono limitati a, PCR, ibridazione genomica comparativa serie 4 (array CGH), Immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP) e sequenziamento, consentendo un'analisi integrativa di campioni di tessuto / tumore.
Protocol
Discussion
Tessuti sottoposte a biopsia o asportato chirurgicamente per l'analisi istopatologica e la diagnosi sono spesso fissati in formalina e paraffina (FFPE) per la conservazione a lungo termine. Con il crescente interesse per comprendere le basi genetiche della malattia, la capacità di estrarre DNA da questi campioni rappresenta una preziosa fonte di materiale diagnostico che può essere utilizzato per l'analisi e gli studi di genomica traslazionale. Storicamente campioni FFPE non sono state considerate una valida fonte per l'analisi molecolare degli acidi nucleici possono essere fortemente modificati dagli acidi nucleici e proteine-proteina-proteina reticolazione 6. Tuttavia, la scoperta che la digestione della proteasi rilascia frammentato acidi nucleici che sono adatti per le analisi a valle tra cui PCR, array CGH, la sequenza e profili di metilazione, consente l'utilizzo di questi esemplari preziosi per l'analisi genetica 6.
Estrazione del DNA da tessuti inclusi in paraffina è una procedura robusta che si basa sulla solubilità differenziale per purificare il DNA. Qualità del DNA estratto e quantità e il successo di amplificazione del DNA successive dipende da una serie di parametri prima, durante e dopo l'estrazione. Questi includono, ma non solo: tipo e la quantità di tessuto, il tipo di fissativo utilizzati per la conservazione dei tessuti, la durata della fissazione, età del blocco di paraffina e condizioni di conservazione, così come la lunghezza del segmento di DNA desiderato di essere amplificato 1,7. Rimozione della paraffina dal tessuto è la fase più critica per l'estrazione di successo come paraffina indisciolto porta a scarsa qualità del campione e l'inibizione della PCR.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare i membri del laboratorio Lam per la loro valutazione e critiche di questo video e articolo. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi degli Istituti canadesi di ricerca sulla salute.
Materials
| Name | Company | Catalogue Number | Comments |
|---|---|---|---|
| Xylene | VWR | CABDH6216- 4 | – |
| 1.7 ml SafeSeal Microcentrifuge Tubes | Sorenson BioScience | 11510 | – |
| Spectrafuge 16M Microcentrifuge | Labnet | C0160-B | – |
| Lysis Buffer | – | – | 10 mM Tris-HCl pH8, 100 mM EDTA pH 8, 50 mM NaCl, 0.5% SDS, 200 μg/ml Proteinase K |
| Proteinase K Stock Solution | Invitrogen | AM2548 | 20 mg/ml |
| Proteinase K Stock Solution | |||
| Buffer Saturated Phenol pH 6.6/7.9 | Fisher | BP1750I-400 | – |
| Phenol: chloroform: Isoamylalcohol (25:24:1, pH 6.7/8.0) | Fisher | BP1752I-400 | – |
| RNase A | Roche | 10109169001 | 100mg |
| 3M sodium Acetate pH 5.2 | – | – | 40.81g NaOAc in 80ml Adjust to pH 5.2 with glacial acetic acid Add dH2O to 100ml Autoclave |
| ND 3300 Spectrophotometer | NanoDrop | – | – |
Referências
- Santos, M. C., Saito, C. P., Line, S. R. Extraction of genomic DNA from paraffin-embedded tissue sections of human fetuses fixed and stored in formalin for long periods. Pathol Res Pract. 204, 633-636 (2008).
- Hilz, H., Wiegers, U., Adamietz, P. Stimulation of proteinase K action by denaturing agents: application to the isolation of nucleic acids and the degradation of ‘masked’ proteins. Eur J Biochem. 56, 103-108 (1975).
- Sambrook, J. o. s. e. p. h., R, D. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2001).
- Kennett, J. Y., Watson, S. K., Saprunoff, H., Heryet, C., Lam, W. L. Technical demonstration of whole genome array comparative genomic hybridization. J Vis Exp. , (2008).
- Thu, K. L. Methylated DNA immunoprecipitation. J Vis Exp. , (2009).
- Tang, W. DNA extraction from formalin-fixed, paraffin-embedded tissue. Cold Spring Harb Protoc. , (2009).
- Hongxin Fan, M. L. G., G, M. L. DNA Extraction from Paraffin-Embedded Tissues. Molecular Pathology Protocols. 49, 1-4 (2001).
